亚硝酸盐还原酶对咸鱼中亚硝酸盐的降解条件与效果研究

王雅楠，吴燕燕，任中阳，李来好，杨贤庆，周婉君

（1.中国水产科学研究院南海水产研究所，农业部水产品加工重点实验室，广东广州510300；2.上海海洋大学食品学院，上海201306）

亚硝酸盐还原酶对咸鱼中亚硝酸盐的降解条件与效果研究

王雅楠1，2，吴燕燕1，任中阳1，2，李来好1，杨贤庆1，周婉君1

（1.中国水产科学研究院南海水产研究所，农业部水产品加工重点实验室，广东广州510300；2.上海海洋大学食品学院，上海201306）

为了探明亚硝酸盐还原酶（Nitrite Reductase，NiRs）对咸鱼中亚硝酸盐的降解作用及应用条件，实验以亚硝酸盐降解量为评价指标，通过单因素实验和Design-expert响应面实验分析咸鱼加工过程中加入亚硝酸盐还原酶（NiRs）的酶浓度、温度、时间的最适条件，并通过测定色差值和感官指标分析NiRs对咸鱼品质的影响。结果表明：NiRs在咸鱼加工中的最佳应用条件是酶浓度4mg/mL、温度34℃、时间5h，亚硝酸盐降解率可达到32.7%。加入NiRs不影响咸鱼的品质，对咸鱼风味有提升作用。研究结果表明在咸鱼生产中添加NiRs可有效降解亚硝酸盐，在保证咸鱼的食用安全性的同时，为腌制水产品的加工提供理论依据和技术支撑。

咸鱼，亚硝酸盐还原酶，亚硝酸盐，降解条件，效果

随着微生物发酵技术的发展，产亚硝酸盐还原酶（NiRs）的乳酸菌得以实现大量生产，从而有利于获取NiRs，为降解腌制品以及其他食品中的亚硝酸盐起到很大的作用［1-2］。国内外学者从多种微生物中获取了亚硝酸盐抑制酶［3-5］。吕玉涛等［6］对NiRs在食品中应用做了初步研究，证明NiRs在最适的反应条件下，加入到亚硝酸盐含量超标的散装人参萝卜、雪里蕻、塑料包装腊肠和腊肉中，反应12h后可以使上述腌制品的亚硝酸盐含量降低到国家安全标准以内。Siavosh和Habibeh［7］研究发现，因亚硝酸盐食用过量而患有胃食管反流病的患者，可通过口服NiRs降低胃部的亚硝酸盐来减缓病情。除此之外，从蜡状芽孢杆菌、胃幽门螺杆菌、铜绿假单胞菌［8-11］、豌豆、玉米和玉米叶［12-14］中均发现了NiRs。目前对于NiRs应用研究的食品主要为肉制品（如香肠［15］、熏肉），土豆［16］，菠菜［17-18］等。其他腌制品比如泡菜，天津冬菜［19-20］中也有初步的应用研究［21］。而有关腌制水产品方面的应用研究较少。咸鱼降解亚硝酸盐的作用主要与咸鱼体内含有的乳酸菌产亚硝酸盐还原酶有关［22-24］，本文以亚硝酸盐降解量为评价指标，通过单因素实验和Design-expert响应面实验研究咸鱼加工过程中加入亚硝酸盐还原酶（NiRs）的酶浓度、温度、时间的最适条件，并通过测定色差值和感官指标分析NiRs对咸鱼品质的影响。旨为实现高效降解腌制水产品中的亚硝酸盐，保证腌制食品的安全与人类健康，为腌制食品安全性加工提供理论依据和技术支撑。

1 材料与方法

1.1 材料与仪器

红三鱼（Red Et pisces）、白立鱼（Piscibus stabit album）、蓝圆鰺（Decapterus maruadsi）、三牙鱼（Tres pisces dentem）、粗海盐 均购自台山市李贵记水产品加工厂；亚硝酸钠（分析纯） 购自天津市福晨化学试剂厂；NiRs 本实验室从咸鱼体乳酸菌中提取，纯化酶活为1134.64U/mg。

UV-2550紫外-可见分光光度计 Shimadzu公司；3-18K/3K30高速台式冷冻离心机 Sigma公司；全自动色差仪SC-80C 北京康光仪器有限公司。

1.2 实验方法

1.2.1 亚硝酸盐降解率的测定 亚硝酸盐测定方法参照国标GB5009.33-2010［25］。

亚硝酸盐降解率（%）=（M0－M1）/M0×100 式（1）

其中：M0—对照组咸鱼中亚硝酸盐含量，μg/mg；M1—实验组咸鱼中亚硝酸盐含量，μg/mg。

1.2.2 咸鱼的腌制 对照组：根据咸鱼加工厂生产咸鱼的方法，将冷冻海鱼红三鱼、白立鱼、蓝圆鰺、三牙鱼去除鱼鳞和内脏，清洗干净。将处理好的原料鱼摆放在腌制池内加入饱和的粗盐溶液，室温下腌制72h，将腌制好的鱼用清水冲洗，去除表面的污渍和盐分，然后将鱼摆放在晒网上晾干表面水分，再将腌鱼放在热泵干燥机中干燥，中间翻面一次，烘干温度28℃，干燥至含水率30%左右。将干燥后的鱼剪取腹部肉，去鱼刺后用绞肉机绞碎。

实验组：腌制方法同对照组，在腌制结束并清洗后，取100g左右的鱼分成若干组，每组鱼中加入NiRs约50m L，将酶液用注射器注入鱼体，使头部、腹部、背部、尾部均匀分布酶液，每组各做两个平行。贴上标签干燥至含水率30%左右。

1.2.3 NiRs在咸鱼加工中的应用条件优化

1.2.3.1 NiRs浓度对亚硝酸盐降解率的影响 在1.2.2实验组中分别加入1、2、3、4、5mg/m L浓度的稀释酶液。对照组不加酶液，所有样品均在35℃条件下放置培养箱2h。每个实验组两个平行。测量鱼肉中亚硝酸盐含量，计算加酶后亚硝酸盐的降解量。

1.2.3.2 不同温度条件下NiRs对亚硝酸盐降解率影响 在1.2.2实验组中，加入5mg/m L等量酶液，将实验组鱼依次放入27、30、33、35、37、40℃培养箱中2h后烘干。对照组不加酶液，每个实验组两个平行。测量鱼体亚硝酸盐含量，计算亚硝酸盐降解量。

1.2.3.3 不同反应时间下NiRs对亚硝酸盐降解率影响 在1.2.2实验组中，加入5mg/m L等量酶液，将实验组鱼放入35℃培养箱中1、2、4、8、12、24h后烘干。对照组不加酶液，每组两个平行。测量鱼体亚硝酸盐含量，计算亚硝酸盐降解量。

1.2.3.4 响应面法优化NiRs在咸鱼工艺中的添加条件 根据单因素实验确定的NiRs最适添加浓度、温度和时间，运用响应面软件design-expert设计实验组合。因素水平设计表如表1所示。

表1 响应面因素水平设计表Table 1 Design on levels and factors of response surface

1.2.4 NiRs对咸鱼品质的影响

1.2.4.1 NiRs对咸鱼色差的影响 咸鱼在生产过程中经过多步骤的处理加工，色差变化较大。加入NiRs后，探究咸鱼的色差变化，可以了解NiRs对咸鱼生产工艺的影响以及咸鱼品质的影响。使用全自动色差仪记录色差读数，使用前用纯白色和纯黑色瓷砖对色差仪调零。

1.2.4.2 感官评定 由8位具有丰富食品感官品尝经验的人员组成感官评定小组。对传统腌制法加工的咸鱼制品和加入NiRs腌制后的咸鱼制品进行外观、气味、咬劲、口感各方面指标的评定，评定时小组成员独立评判，避免互相交谈。每次评定一个样品后用蒸馏水漱口，避免味觉疲劳。评分标准见表2。

表2 感官评价标准Table 2 Sensory evaluation standards of salted fishes

1.3 数据处理

使用Design-expert对实验结果进行方差分析，做出响应曲面图。依照响应面分析软件得出的最优条件组合进行验证实验。验证亚硝酸盐含量是否明显降低。色差影响实验中不同实验组的色差变化，记录数值并计算方差。感官评定实验按照食品感官评定标准进行打分，满分100分，计算平均值及方差。

2 结果与讨论

在预实验中除了考察NiRs的条件对咸鱼色差、感官的影响，同时也考察了对咸鱼水分含量、盐度、灰分的影响。预实验发现加入NiRs对咸鱼的水分、灰分、盐度指标无明显影响。因此本实验中不考虑这些因素。

2.1 NiRs在咸鱼加工中的作用条件单因素实验

2.1.1 NiRs浓度对亚硝酸盐降解率的影响 在咸鱼加工过程中，NiRs浓度增加后，NiRs活性增大，亚硝酸盐的含量减少，亚硝酸盐降解率增大，如图1所示。根据实验结果，NiRs能够有效降低咸鱼中亚硝酸盐的含量，在浓度4～5mg/m L条件下亚硝酸盐降解量最大。不加酶的对照组的亚硝酸盐含量为3.688μg/g，在NiRs浓度是4mg/m L时咸鱼中亚硝酸盐含量最低为3.007μg/g，亚硝酸盐降解率达到18.451%。

图1 酶浓度对亚硝酸盐降解率的影响Fig.1 Effects on nitrite degradation of different NiRs'concentrations

2.1.2 不同温度条件下NiRs对咸鱼中亚硝酸盐降解率影响 温度对于酶活性的影响很大，将加入等量酶液的腌制鱼放入不同温度的培养箱中，亚硝酸盐降解率测定结果如图2所示。NiRs对咸鱼中亚硝酸盐降解率的影响呈正态分布变化，不加酶对照组的亚硝酸盐含量为4.329μg/g。温度较低时酶活性受到抑制，随着温度增加，NiRs酶活性逐渐增大，亚硝酸盐降解率逐渐增加。在35℃条件下亚硝酸盐降解率达到最大，此时的亚硝酸盐含量为3.077μg/g，亚硝酸盐降解率达到28.912%。超过最大值后，酶活性逐渐呈下降趋势，亚硝酸盐降解率也逐渐减小。这是由于温度较高时导致部分酶活性丧失。这说明温度对于NiRs降解亚硝酸盐的效果影响明显。因此，亚硝酸盐降解量最大在35℃左右，这与NiRs的最适温度的酶学性质研究结果相同。

图2 反应温度对亚硝酸盐降解率的影响Fig.2 Effects on nitrite degradation of different temperatures

2.1.3 不同反应时间下NiRs对咸鱼中亚硝酸盐降解率影响 在其他条件相同的前提下，控制咸鱼加工过程中加入NiRs的反应时间，测量结果如图3所示。不加酶对照组的亚硝酸盐含量为4.371μg/g。随着时间的增加，NiRs的降解效果逐渐明显，亚硝酸盐降解率逐渐增大。在4h时亚硝酸盐降解率达到最大，此条件下测得的亚硝酸盐含量为3.180μg/g，降解率达到27.241%。超过4h后，亚硝酸盐降解率有明显降低趋势，可能由于温暖的条件下长时间放置咸鱼，鱼体蛋白质分解又产生亚硝酸盐，导致测得的亚硝酸盐降解率下降。超过10h后，咸鱼鱼肉有明显刺鼻气味，超过12h以后，虽然亚硝酸盐降解率上升，但有可能是咸鱼体内细菌产酸对亚硝酸盐进行了酸降解。由结果可知，控制NiRs反应时间4h为最佳。

图3 反应时间对亚硝酸盐降解率的影响Fig.3 Effects on nitrite degradation of different times

表3 响应面设计方案与实验结果Table 3 Results of response surface

2.1.4 响应面法优化NiRs在咸鱼工艺中的添加条件

根据Design-expert的中心组合实验设计原理，综合酶浓度、温度和时间单因素实验结果。以亚硝酸盐降解率为响应值，在单因素实验基础上采用三因素三水平的响应面分析方法。根据软件设计的实验组方案进行实验后，得到NiRs降解率结果如表3所示。

根据17组实验结果，用Design-expert软件进行回归拟合分析，得出三种因素变量和亚硝酸盐降解率的关系可以用函数表示：

为了说明回归方程的有效性，对回归模型进行方差分析，结果如表4所示。回归方程R2=0.987，方程的p＜0.0001，说明回归模型极显著。所以说这个实验模型能可靠表示出酶浓度、酶作用温度和酶作用时间之间的交互关系。方程失拟项为p=0.5983＞0.05，故失拟项不显著。说明此模型拟合度好，实验误差较小。因此可以用该回归方程对实验结果进行分析。根据交互项方差分析结果来看，酶浓度与温度的交互作用AB项的F值为9.52，p值0.0177＜0.05，这说明酶浓度与温度交互作用对亚硝酸盐降解量的影响显著。

表4 回归方程方差分析Table 4 Analysis of regression equation variance

根据回归方程方差分析结果，用Design-expert软件分析，得到拟合响应曲面图，如图4～图6所示。从图4～图6中可直观看出NiRs的酶浓度、温度、时间交互作用对亚硝酸盐降解率的影响。由表4可知，比较F值可以看出，反应温度对亚硝酸盐降解率的影响比酶浓度和反应时间的影响大，相比较而言，亚硝酸盐降解率对酶浓度变化较不敏感。影响亚硝酸盐降解率的因素大小依次为温度、反应时间、酶浓度。

通过Design-expert软件分析得到，NiRs降解亚硝酸盐的最佳优化条件是酶浓度4.1mg/m L，温度34.4℃，时间4.7h，亚硝酸盐降解率可达到32.799%。软件给出的条件数值精确，在实际生产中不易操控，因此修正实验条件为酶浓度4mg/m L，温度34℃，时间5h，根据此条件进行验证实验，得到亚硝酸盐降解率为32.7%。根据响应面所得实验结果可知，在咸鱼加工过程中加入NiRs，其酶浓度、酶反应温度、酶反应时间均对亚硝酸盐的最终降解率有极显著（p＜0.01）的影响，并且酶浓度与酶反应温度的交互作用较明显，而酶浓度与酶反应时间，酶反应时间与酶反应温度之间的交互作用对亚硝酸盐降解率的影响较为不明显。三因素最优的条件组合为酶浓度4mg/m L，温度34℃，时间5h。

图4 酶浓度-温度的交互影响Fig.4 The interaction of NiRs'concentrations and temperature

图5 酶浓度-时间的交互影响Fig.5 The interaction of NiRs'concentrations and times

图6 温度-时间的交互影响Fig.6 The interaction of times and temperature

目前对NiRs的应用研究较少，吕玉涛［6］对NiRs在散装人参萝卜、雪里蕻、塑料包装腊肠、腊肉中的应用做了初步研究，结果显示在加酶12h后这几种食品的亚硝酸盐可降低到国家规定的食品安全标准以下。郑怀忠［26］研究NiRs在香肠中的应用，采用的原料有猪肉小香肠，鸡肉香肠，伯尔尼舌肠，乡村烤香肠，法兰克福小香肠以及白香肠。研究结果显示，几组香肠的亚硝酸盐降解率最高的是乡村烤香肠，达到93.45%，亚硝酸盐降解率最低的是猪肉小香肠，为72.71%。本研究证明在咸鱼加工过程中加入NiRs同样可以降解亚硝酸盐。咸鱼中的亚硝酸盐降解率低于香肠，原因可能是香肠中的亚硝酸盐含量本身较高，因此测出的亚硝酸盐降解率更高，而咸鱼制品中的亚硝酸盐含量不高。香肠是肉糜，添加NiRs可以均匀作用，而咸鱼本身鱼体各部分就不同，不易均匀添加。除此之外，香肠原料是畜牧产品，与水产品差异较大。本实验中由于原料的限制，加入酶液的浓度较低，可通过进一步实验提高酶浓度增加亚硝酸盐的降解率。

表5 NiRs对咸鱼色差的影响Table 5 Effects on chromatic aberration of salted fish by NiRs

2.2 NiRs对咸鱼品质的影响

2.2.1 NiRs对咸鱼色差的影响 加入不同浓度的NiRs，与不加酶的对照组对比，记录不同实验组的色差变化，结果如表5所示，方差分析结果见表6。实验组与对照组相比，L*，a*，b*值均略有减小。方差分析中PL、Pa、Pb均大于0.05，在0.05水平上变化均不显著。

由于实验组与对照组相比，色差属于微小范围，所以可以认为，咸鱼加工过程中加入NiRs后，对咸鱼制品的色差无明显影响。

表6 咸鱼色差方差分析表Table 6 Anova of chromatic aberration of salted fish

2.2.2 感官评定结果 在咸鱼腌制过程中加入NiRs后进行感官评价，与传统腌制方法加工的咸鱼做对比，结果如表7所示。咸鱼腌制过程中加入NiRs后，外观、咬劲、口感和总评与传统加工方法相比差异显著（p＜0.05），并且比传统腌制法得到的咸鱼分值高。仅有气味一项两种加工方法差异不显著（p＞0.05）。实验说明在咸鱼腌制过程中，加入NiRs可以促进咸鱼中风味物质的形成，在感官上比传统加工的咸鱼有一定提升，能改善咸鱼制品的风味。

表7 感官评定结果Table 7 The result of sensory valuation

3 结论

研究表明，将NiRs应用到咸鱼加工生产中，可以有效降低咸鱼产品亚硝酸盐的含量，咸鱼加工过程中加入NiRs，不影响咸鱼产品的风味、色泽。通过对NiRs在咸鱼加工中的应用条件进行研究和优化，响应面实验分析得到生产的最佳酶作用条件为：酶浓度4mg/m L，温度34℃，时间5h，产品中亚硝酸盐降解率为32.7%。在腌制鱼加工过程中加入NiRs可降解亚硝酸盐，对传统加工的咸鱼和加酶加工的咸鱼进行色差和感官分析，结果表明NiRs不影响咸鱼的风味和色泽，并且对咸鱼风味有一定的提升作用。

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Nitrite degradation conditions and effect of nitrite reductase in salted fish

WANG Ya-nan1，2，WU Yan-yan1，REN Zhong-yang1，2，LILai-hao1，YANG Xian-qing1，ZHOUW an-jun1
（1.South China Sea Fisheries Research Institute，Chinese Academy of Fishery Sciences，Key Laboratory of Aquatic Product Processing of Ministry of Agriculture，Guangzhou 510300，China；2.College of Food Science and Technology，Shanghai Ocean University，Shanghai201306，China）

In order to explore application conditions on nitrate reductase，nitrite degradation was the evaluationindex. The paper analyzed the optimum conditions of nitrite reductase by single-factors and Design-expertresponse surface experiments. The impact of NiRs was analysis on quality of salted fish through color differencevalue and sensory indicators. The optimum conditions were enzyme concentration 4mg/mL，reaction temperature34℃，reaction time 5h. The degradation rate of nitrite reached 32.7％. Analysis showed that NiRs had no badeffects on the color and sensory of salted fish. NiRs had been raised the flavor of salted fish. The resultsshowed that adding NiRs to salted fish production would effectively degrade nitrite. It ensured the edible safetyof salted fish. The experiments provided theoretical basis and technical support for aquatic products processing.

salted fish；nitrite reductase；nitrite；degrade condition；effect

TS254.1

A

1002-0306（2015）08-0210-06

10.13386/j.issn1002-0306.2015.08.035

2014－06－08

王雅楠（1987-），女，硕士研究生，研究方向：水产品加工与蛋白质工程。

国家自然科学基金资助项目（31371800）；中国水产科学研究院基本科研业务费资助（2014C05XK01）；广东省海洋渔业科技推广专项（A201201I04，A201301C01）。