柚子皮渣生产单细胞蛋白饲料工艺研究

张海涛 杨海君 刘文斌等

摘 要：以柚子皮渣为原料，以康宁木霉、白地霉、酵母菌、产朊假丝酵母为菌体，用卵清蛋白为标准品和双缩脲试剂制定标准曲线，探究单菌株与混合菌株分别固态发酵后产单细胞蛋白的含量。结果表明：白地霉与康宁木霉组合菌发酵效果最好，培养基发酵7d后蛋白质含量达到8.060g，占培养基干重的19%左右。发酵效果受温度、pH值、接种量、培养基含水量等因素影响，用正交实验获得白地霉与康宁木霉最佳发酵条件组合为：最适pH值5.5，最适发酵温度25℃，最适接种量15%，最适培养基含水量65%，且各因素对发酵的影响大小为发酵温度>培养基含水量>接种量>pH。

关键词：固态发酵；单细胞蛋白；影响因素；单菌；混合菌

中图分类号 S816.4 文献标识码 A 文章编号 1007-7731（2015）19-105-04

Study on the Process of Producing Single Cell Protein Feed by the Skin of Grapefruit

Zhang Haitao1，2 et al.

（1 Hunan Agricultural University，Changsha 41000，China；2 Hunan University of Science and Engineering，Yongzhou 425000，China）

Abstract：Taking grapefruit bran as raw material，koningii，white mold，yeast，geotrichum as fermentation bacteria.through the standard curve with ovalbumin and Biuret reagent. the paper probed the single cell protein content after solid-state fermentation of single strain and mixed strain. It was found that the combination of Geotrichum with koningii has the best fermentation effect，and after 7d fermentation the medium content 8.060g protein，accounting for about 19% of the dry weight of the medium.Fermentation affected by the temperature，pH，inoculum size，mediums water content. The orthogonal experiment showed that the combination of Geotrichum with koningii s best fermentation condition ，the optimum pH value is 5.5，the optimum fermentation temperature is 25℃，the optimum inoculation amount is 15%，the optimum medium moisture content is 65%. The impact of various factors on fermentation is fermentation temperature>mediums water content> inoculation amount>pH.

Key words： Solid state fermentation；Single cell protein；Influencing factors；Single strain；Mixed strain

传统柚子果实加工后剩下的大量柚子皮往往被随意丢弃或集中作一般处理，对环境造成污染的同时也造成了资源浪费。研究表明，柚子皮中含有5%的果胶，还含有丰富的油皮苷、胡萝卜素、VB、VC、VP以及有机酸和高级醇，并且可以提取精油、柚苷[1]，因此柚子皮可以作为一种发酵基质，为微生物的生长提供丰富的营养成分。单细胞蛋白所含的物质成分丰富，被广泛用于饲料加工中，通过柚子皮渣固态发酵来生产单细胞蛋白，从而提高柚子皮中粗蛋白含量，使柚子皮作为一种饲料供动物食用，同时解决了废弃柚子皮渣对环境的污染，具有良好的社会效益和经济效益。本研究以柚子皮渣为原料，以白地霉、酵母菌、产朊假丝酵母、康宁木霉单菌种以及它们的混合菌种为发酵菌种[2]，筛选出最佳混菌组合以及最佳发酵条件，对提高柚子皮渣固态发酵效率和粗蛋白产量，以及保护生态环境具有重要意义。

1 材料与方法

1.1 材料

1.1.1 培养基 （1）牛肉膏琼脂培养基：在烧杯内加蒸馏水100mL，放入牛肉膏0.3g，蛋白胨1.0g，氯化钠0.5g，琼脂1.5g。烧杯外标记，加热溶解后加入琼脂，不断搅拌以免粘底。等琼脂完全溶解后补足失水，用10%盐酸或10%的氢氧化钠调整pH值为5.0～6.5，分装在各个试管内，高压蒸汽锅内121℃灭菌30min，室温后倒入试管制成斜面（8个），冷却后保存备用。（2）液体牛肉膏培养基制备：在烧杯内加蒸馏水100mL，放入牛肉膏0.3g，蛋白胨1.0g，氯化钠0.5g。烧杯外标记，加热溶解，补足失水，用10%盐酸或10%的氢氧化钠调整pH值为5.0～6.5，分装于8个三角瓶中，高压蒸汽锅内121℃灭菌30min，冷却至室温后备用。（3）柚子皮渣固体发酵培养基制备：柚皮渣80g，麸皮20g，尿素1.5g，硫酸铵1.5g，磷酸氢二钾0.6g，硫酸镁0.05g，水65～70g，用10%盐酸或10%的氢氧化钠调pH值为5.0～6.5，高压蒸汽锅内121℃灭菌20min。

1.1.2 主要试剂与仪器 硫酸铵、磷酸氢二钾、硫酸镁为分析纯，购于上海永叶生物科技有限公司；其它化学试剂均为分析纯。TG16C/TG16台式高速离心机，PHS-802中文台式酸度计，722型分光光度计等。

1.1.3 菌种 4株菌株都为真菌，分别为白地霉（Geotrichum candidum）；产朊假丝酵母（Candida utilis）；康宁木霉（Corning Trichoderma）；酵母菌（Yeast）。从武汉的中国典型培养物保藏中心（CCTCC）购买，放冰箱冷冻保藏备用。

1.1.4 柚皮渣与麸皮来源 柚子为江永的香柚，将柚子洗干净剥开，取其柚子皮（果实以外的部分）用刀切成小块状，然后放入干燥箱里烘干至恒量，用研钵研碎，过100目筛，放干燥处室温保存备用。所用的麸皮从永州市零陵区的农产品市场购买，然后经过20目筛筛选后保存备用。

1.2 方法

1.2.1 双缩脲试剂的配制 将1g氢氧化钠溶于10mL水中，制成双缩脲试剂A；将0.1g硫酸铜溶于10mL水中，制成双缩脲试剂B。

1.2.2 菌种的活化与保藏 将冷冻保存的4菌株接种于4个斜面培养基上活化，在22～35℃条件下培养48h，再将斜面菌种挑取一环接于液体试管培养基中，22～35℃培养48h，作为一级种子培养基；以10%接种量接入装液量20mL/50mL于三角瓶液体培养基中，于22～35℃ 240r·min-1振荡培养24h，作为二级种子培养基，保存备用。

1.2.3 标准曲线的制作 用卵清蛋白作为标准样品制作标准曲线。准确称取卵清蛋白，以蒸馏水为溶液配制成2.0mg·mL-1的蛋白质溶液，取0、0.3、0.6、0.9、1.2、1.5、1.8mL分别注入7支比试管中，先加入双缩脲试剂A再加入双缩脲试剂B，在15～25℃下放置30min，以介质溶液调零，测定标准液在560nm处的吸光度。

1.2.4 单菌种的发酵 用移液枪分别取4种二级种子培养液各4mL接种于4个不同的已灭菌的柚皮渣固态发酵培养基上（每取不同菌种时更换一次枪头），置于22℃培养箱，培养7d，然后在烘箱中65℃烘干至恒重，以粗蛋白质含量为检测指标，分析各个菌种发酵前后产物中蛋白质含量的变化情况。

1.2.5 组合菌株的发酵 （1）双菌种的发酵。将4菌株分别“两两组合”，同时按1∶1的比例各取2mL二级种子培养液接种于已灭菌的柚皮渣固态发酵培养基上（每取不同菌种时更换一次枪头）置于22℃培养箱，培养7d，然后在烘箱中65℃烘干至恒重，记录数据。（2）3菌种的发酵。将4菌株分别“三三组合”，同时按1∶1∶1的比例各取1.3mL二级种子培养液接种于已灭菌的柚皮渣固态发酵培养基上（每取不同菌种时更换一次枪头）置于22℃培养箱，培养7d，然后在烘箱中65℃烘干至恒重，记录数据。（3）4菌种的发酵。将4菌株分别按1∶1∶1∶1的比例各取1mL二级种子培养液接种于已灭菌的柚皮渣固态发酵培养基上（每取不同种菌种时更换一次枪头）置于22℃培养箱，培养7d，然后在烘箱中65℃烘干至恒量。

1.2.6 粗蛋白质含量的测定 （1）单菌种发酵培养皿中粗蛋白质含量的测定：从单菌种发酵的4个培养皿中取烘干之后的培养物各5g，分别用研钵研碎后倒入试管中，然后滴加95%乙醇，摇晃试管5min，取上清液于离心管中，反复3次，离心完成之后倒掉液体，先加入双缩脲试剂A再加入双缩脲试剂B（共2mL，A∶B=3∶1），摇晃离心管，然后将双缩脲倒入分光光度计玻璃柱中进行检测。（2）组合菌种发酵培养皿中粗蛋白质含量的测定：从组合菌种发酵的4个培养皿中取烘干之后的培养物各5g，分别用研钵研碎后倒入试管当中，然后滴加95%乙醇，摇晃试管5min，取上清液于离心管中，反复3次，离心完成后倒掉液体，先加入双缩脲试剂A再加入双缩脲试剂B（共2mL，A∶B=3∶1），摇晃离心管，然后将双缩脲倒入分光光度计玻璃柱中进行检测。

1.2.7 发酵因子对最佳菌种组合产粗蛋白质量的影响[3-4]

1.2.7.1 发酵温度 按1∶1取相同体积的康宁木霉与白底霉菌溶液各2mL混合，平均加入到7个已灭菌的固态柚子皮渣培养基中，分别放入温度为10、15、20、25、30、35、40℃恒温箱中培养7d，检测不同温度产物中蛋白质含量。

1.2.7.2 发酵pH值 按1∶1取相同体积的康宁木霉与白底霉溶液各2mL混合，平均加入到7个已灭菌的固态柚子皮渣培养基中，分别调节pH值为4.5、5.0、5.5、6.0、6.5后放入25℃恒温箱中培养7d，检测不同pH值条件下产物中蛋白质含量。

1.2.7.3 接种量 按照1∶1取相同体积的康宁木霉与白底霉溶液分别以接种量10%、15%、20%、25%、30%对固态柚子皮渣培养基进行发酵，调pH值为5.5，放入25℃恒温箱中培养7d，检测产物中蛋白质含量。

1.2.7.4 培养基的含水量 按1∶1取相同体积的康宁木霉与白底霉溶液各2mL，平均加入到7个已灭菌的固态柚子皮渣培养基中（pH值为5.5），分别调节培养中的含水量为50%、55%、60%、65%、70%，放入25℃恒温箱中培养7d，检测产物中蛋白质含量。

1.2.8 正交实验 发酵温度、pH值、接种量、培养基的含水量都对菌种的生长代谢产生影响，通过取4因素（温度、pH、目筛目数、含水量）3水平的正交实验来确定最佳发酵条件组合[5]。

2 结果与分析

2.1 标准曲线 用卵清蛋白作为标准样品来制作标准曲线，通过计算称量后，准确称取卵清蛋白，以蒸馏水为溶液配制成2mg·mL-1的蛋白质溶液，分别取出0、0.3、0.6、0.9、1.2、1.5、1.8mL注入7支比试管中，先加入双缩脲试剂A再加入双缩脲试剂B（共2mL，A∶B=3∶1），在15～25℃下放置30min，调零，测定560nm处的吸光度依次为0、0.182、0.311、0.453、0.581、0.705、0.837，根据数据绘制标准曲线，如图1所示。

<＼＼Pc10＼工作盘 （E）＼姜秀红＼杂志＼安徽农学通报杂志＼2015-19农学通报内文＼w763-1.tif>[y=0.4556x+0.0284

R2=0.9969][标准蛋白质溶液体积（mL）][吸光度（A）][1

0.8

0.6

0.4

0.2

0][0 0.3 0.6 0.9 1.2 1.5 1.8 2.1]

图1 标准曲线

2.2 粗蛋白质的检测结果 根据测得的吸光度通过标准曲线计算出待测液浓度值，经换算可得粗蛋白产量。

2.2.1 单菌种发酵后粗蛋白的检测结果 康宁木霉、产阮假丝酵母、酵母菌、白地霉4菌种分别发酵后的粗蛋白含量为5.377g、4.723g、4.197g、6.316g，白地霉发酵获得的粗蛋白含量最高，达到6.316g。

2.2.2 混合菌种发酵后粗蛋白质含量的检测结果 不同菌种混合在相同条件下发酵后的粗蛋白含量如表1所示，从表1可知，11组混合菌中，白地霉与康宁木霉组合发酵产生的粗蛋白含量最高，达到8.060g。

表1 不同混菌组合发酵后产生的粗蛋白质含量

[菌种组合＼&粗蛋白质含量（g）＼&产阮假丝酵母+酵母菌＼&5.589＼&白地霉+康宁木霉＼&8.060＼&康宁木霉+酵母菌＼&5.786＼&白地霉+产阮假丝酵母＼&7.155＼&白地霉+酵母菌＼&4.098＼&康宁木霉+产阮假丝酵母＼&4.240＼&康宁木霉+产阮假丝酵母+酵母菌＼&4.125＼&康宁木霉+白地霉+酵母菌＼&5.554＼&产阮假丝酵母+酵母菌+白地霉＼&5.506＼&康宁木霉+产阮假丝酵母+白地霉＼&5.272＼&康宁木霉+产阮假丝酵母+白地霉+酵母菌＼&6.650＼&]

2.2.3 白地霉与康宁木霉混合固态发酵所产粗蛋白的影响因子分析 白地霉与康宁木霉组合在同等条件下固态发酵后所产粗蛋白含量最高，取该菌种组合进行影响因子分析，探寻该菌种组合最佳固态发酵条件。

2.2.3.1 不同温度对发酵产物中粗蛋白含量的影响 分别以10、15、20、25、30、35、40℃进行分组发酵试验，发酵后培养基中粗蛋白的含量如图2所示，从图2可知，当温度为10～25℃时，发酵后产物中的蛋白质含量不断增加，且温度为25℃时，产物中粗蛋白含量为最高，达到8.46g；当温度为25～40℃时，发酵后产物中的粗蛋白含量呈下降趋势，且温度在35～40℃范围内下降得最为明显。因此，可认定25℃为康宁木霉与白地霉菌种组合的最佳反应温度。

<＼＼Pc10＼工作盘 （E）＼姜秀红＼杂志＼安徽农学通报杂志＼2015-19农学通报内文＼w763-2.tif>[粗蛋白含量（g）][10

8

6

4

2

0][0 10 20 30 40 50][温度（℃）][1.331][5.321][7.941][8.460][7.772][7.125][3.125]

图2 温度对白地霉与康宁木霉组合发酵后产物中粗蛋白含量的影响

2.2.3.2 不同pH值对发酵产物中粗蛋白含量的影响 pH值对白地霉与康宁木霉组合发酵产物中粗蛋白含量的影响如图3所示。从图3可知，该菌种组合发酵产物粗蛋白含量在pH值4～4.5以及5.5～7之间出现先增长后减少的趋势，而在pH值为5.5时发酵后的粗蛋白产量最高，达到8.161g。因此，可得出pH5.5为康宁木霉与白地霉组合菌种的最佳反应酸碱度。

<＼＼Pc10＼工作盘 （E）＼姜秀红＼杂志＼安徽农学通报杂志＼2015-19农学通报内文＼w763-3.tif>[9

8

7

6

5][粗蛋白含量（g）][4.5 5 5.5 6 6.5 7][pH值][5.321][6.941][8.161][7.027][6.125]

图3 pH值对白地霉与康宁木霉组合发酵后产物中粗蛋白含量的影响

2.2.3.3 不同接种量对发酵产物中粗蛋白含量的影响 通过接种量的改变，来检测不同接种量对发酵产物中粗蛋白含量的影响。从图4可知，该组合菌种固态发酵后产物中粗蛋白产量随着接种量的改变而改变，当接种量为15%时，最有利于发酵产物中粗蛋白的产生。

<＼＼Pc10＼工作盘 （E）＼姜秀红＼杂志＼安徽农学通报杂志＼2015-19农学通报内文＼w763-4.tif>[8.4

8.2

8

7.8

7.6

7.4][粗蛋白含量（g）][10 15 20 25 30 35][接种量（%）][7.43][8.25][8.11][7.92][7.82]

图4 接种量对白地霉与康宁木霉组合发酵后产物中粗蛋白含量的影响

2.2.3.4 不同培养基含水量对发酵后产物中粗蛋白含量的影响 不同培养基含水量对发酵后产物中粗蛋白含量的影响如图5所示，从图5可知，培养基含水量在50%～70%，该组合菌种发酵后产物中产粗蛋白的量都比较高，当培养基含水量为65%时，发酵后产物中的粗蛋白产量最高，达到8.075g。这是因为影响固态发酵速率的因素与是否有游离水的存在相关，因此基质含水量的变化对微生物的代谢与生长产生重要的影响。戴超[4]在影响固态发酵速率的因素及其控制策略中通过验证实验也证明了这一点，可知培养基含水量在65%为康宁木霉与白地霉组合菌种的最佳反应环境。

<＼＼Pc10＼工作盘 （E）＼姜秀红＼杂志＼安徽农学通报杂志＼2015-19农学通报内文＼w763-5.tif>[9

8.58

7.5

7

6.5][粗蛋白含量（g）][50 55 60 65 70 75][培养基含水量（%）][6.845][7.883][8.102][8.705][8.012]

图5 培养基含水量对地霉与康宁木霉组合发酵后产物中

粗蛋白含量的影响

2.4 正交实验结果 取4因素3水平的正交实验确定最佳发酵组合如表2所示，从表2可知，最适水平最佳配比组合为A2B2C3D2。从正交表数据可知，温度25℃、pH值5.5、最佳接种量为15%、培养基含水量65%为最佳条件组合，由R值可知，各因素对发酵的影响大小为发酵温度>培养基含水量>接种量>pH。

表2 4因素3水平正交实验结果

[试验号＼&温度

（℃）＼&pH＼&接种量

（%）＼&培养基含

水量（%）＼&粗蛋白质量（g）＼&1＼&1（15）＼&1（4.5）＼&1（10）＼&1（60）＼&6.026＼&2＼&1（15）＼&2（5.5）＼&2（15）＼&2（65）＼&7.161＼&3＼&1（15）＼&3（6.5）＼&3（20）＼&3（70）＼&8.072＼&4＼&2（25）＼&1（4.5）＼&2（15）＼&3（65）＼&8.883＼&5＼&2（25）＼&2（5.5）＼&3（20）＼&1（60）＼&8.436＼&6＼&2（25）＼&3（6.5）＼&1（15）＼&2（65）＼&6.535＼&7＼&3（35）＼&1（4.5）＼&3（20）＼&2（65）＼&4.323＼&8＼&3（35）＼&2（6.5）＼&1（10）＼&3（70）＼&4.251＼&9＼&3（35）＼&3（6.5）＼&2（15）＼&1（60）＼&3.377＼&Ⅰ＼&14.564＼&13.936＼&16.812＼&17.839＼&T=57.064＼&Ⅱ＼&25.391＼&19.232＼&19.421＼&18.019＼&Ⅲ＼&11.911＼&17.984＼&20.831＼&21.206＼&K1＼&4.854＼&4.312＼&5.604＼&4.170＼&K2＼&8.463＼&6.410＼&6.474＼&6.999＼&K3＼&3.970＼&5.995＼&6.944＼&7.069＼&R＼&4.493＼&2.098＼&1.340＼&2.899＼&]

3 结论

（1）白地霉、产朊假丝酵母、康宁木霉与酵母菌分别发酵培养后产生的粗蛋白含量为5.377g、4.723g、4.197g、6.316g，白地霉发酵后产生的粗蛋白质含量最高，达到6.316g。

（2）白地霉、产朊假丝酵母、康宁木霉与酵母菌分别进行2菌种、3菌种以及4菌种混合固态发酵，检测固态发酵产物中发现康宁木霉与白地霉混合柚子皮渣生产蛋白质量高，达到8.060g，占培养基干重的19%左右。

（3）正交实验采用3水平（温度：A1=15℃，A2=25℃，A3=35℃；pH值：B1=4.5，B2=5.5，B3=6.5；接种量：C1=10%，C2=15%，C3=20%；培养基含水量：D1=60%，D2=65%，D3=70%）4因素（发酵温度，pH，接种量，培养基含水量）进行设计，结果发现康宁木霉与白地霉菌种混合组最佳条件组合为A2B2C3D2，即在温度25℃、pH5.5、接种量15%、培养基含水量65%的条件下最有利于柚子皮渣培养基的发酵。

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