不同种植物叶中黄酮的提取及比较

陈生锟　等

【摘 要】用超声波提取法对三种植物叶进行单因素提取实验，并用索氏提取法和微波提取法作了对比试验，然后对超声波提取法进行了正交试验并确定了最优提取条件。得出不同植物叶中黄酮提取率最高的方法为超声提取法，其最佳提取工艺分别为银杏：70%乙醇，时间50 min，料液比1：20，温度70 ℃。竹叶：70%乙醇，时间40 min，料液比1：22，温度60 ℃。杜仲：50 %乙醇，时间40 min，料液比1：22，温度60 ℃。通过该实验对比得出不同植物中提取黄酮含量最高的方法为超声波提取法，确定了不同植物中黄酮提取含量的最高的植物为竹叶。

【关键词】黄酮 微波法 超声提取波 正交试验

1材料与方法

（1）材料与仪器。样品：银杏叶、竹叶采自毕节，杜仲采自织金，均为2013年10月份采摘，洗净，烘干，粉碎，备用。

试剂：芦丁标准品、乙醇（无水乙醇）、氢氧化钠（分析纯）、硝酸铝（分析纯）、亚硝酸钠（分析纯）

（2）标准曲线的绘制。取100度下干燥之恒重的芦丁15.26 mg，用50%乙醇配制浓度0.50 mg/mL的芦丁标准品，取上述芦丁标准溶液0 mL、l mL、2 mL、3 mL、4 mL、5 mL、6 mL，分别转入25 mL容量瓶中，加l mL5%的NaN02，6 min后加入10%1 mLAI（NO3）3，6 min后加入10 mL 4%NaOH充分振荡摇匀，用蒸馏水定容至刻度，静置30 min后，以芦丁含量为0.000 mg/mL的标准溶液为参比，于500 nm处测定吸光度（Abs），得回归方程：Y=9.3036X+0.0077，相关系数R2=0.9992。

（3）样品黄酮含量的计算。吸取5ml的提取样品至于25ml容量瓶中，按上述绘制芦丁标准曲线的步骤配制提取溶液，测量提取液的吸光度A，按下面的公式计算出植物叶黄酮的含量：

黄酮含量

式中C一由测得的吸光值代入回归方程计算得到的黄酮浓度，mg/mL

V一溶液的体积，mL ； 为黄酮的百分含量；m为称取样品的质量，g

（4）索氏提取法提取不同种植物叶中黄酮类化合物。准确称取竹叶、银杏叶、杜仲叶粉末各5.000 g于索氏提取仪中，在70%乙醇，时间2 h，料液比1：20的条件下，用100 mL乙醇进行索氏提取之无色，趁热旋蒸浓缩，后冷冻12 h，过柱（活性炭和氧化铝）除去叶绿素，置于50 mL容量瓶用50%乙醇定容[3]。按“1.2”方法测定吸光度，并根据标准方程和黄酮含量的计算公式求出不同植物中黄酮化合物的含量分别为：竹叶0.497%、银杏0.746% 、杜仲0.629%。（对比试验）

（5）微波提取法提提取不同种植物叶中黄酮类化合物。准确准确称取竹叶、银杏叶、杜仲叶粉末各5.000 g，加入到圆底烧瓶中，在70%乙醇，时间50 min，功率400 W，温度70 ℃的条件下，用100 mL乙醇进行微波提取，趁热旋蒸浓缩，后冷冻12 h，过柱（活性炭和氧化铝）除去叶绿素，置于100 mL容量瓶用50%乙醇定容[4]。按“1.2”方法测定吸光度，并根据标准方程和黄酮含量的计算公式求出不同植物叶中黄化合物的含量分别为：竹叶 0.660%银杏0.866% 杜仲1.165%。（对比试验）

（6）超声波提取法提取不同种植物叶中黄酮类化合物。准确称取竹叶、银杏叶、杜仲叶粉末各5.000g，加入到圆底烧瓶中，用不同的乙醇浓度、超声时间、料液比、超声温度分别进行单因素影响实验。 为全面考察超声波取法提取不同种植物叶中黄酮类化合物的影响因素[5]，在单因素实验的基础上，选取各单因素的最优条件，设计正交实验L9（34），确定植物叶黄酮的最佳提取条件。

2 结果与分析

2.1 超声波提取单因素实验

（1）乙醇浓度对黄酮提取的影响 称取竹叶、银杏叶、杜仲叶粉末各5.000 g ，分别用浓度为30%、50%、70%、95%的乙醇溶液在50 ℃ ，料液比（g：mL）1：20 ，超声波功率50 Hz提取30 min ，趁热旋蒸浓缩 ， 加石油醚萃取叶绿素，后用50%乙醇稀释定容至50 mL ，测定其吸光值 ，得黄酮含量与乙醇浓度之间的关系，实验结果见图1。

图1乙醇浓度对黄酮含量的影响

由图1可知，银杏叶在乙醇浓度为70%时，总黄酮的含量最高，之后趋于平缓，因此乙醇浓度为70%为最佳。竹叶在70%时，总黄酮含量最高，之后下降，所以70%为竹叶最佳的乙醇提取浓度。杜仲叶在30%～50%时黄酮含量呈上升趋势，50%～95%趋于下降，所以50%为最佳提取浓度。

（2）提取时间对黄酮提取的影响 称取竹叶、银杏叶、杜仲叶粉末各5.000 g ，分别以30 min、40 min、50 min、60 min的不同提取时间在50 ℃ ，料液比（g：mL ）1：20 ，50 Hz超声波提取。趁热旋蒸浓缩 ， 加石油醚萃取叶绿素，后用50%乙醇稀释定容至50 mL ，测定其吸光值 ，得黄酮含量与提取时间之间的关系，实验结果见图2。

图2提取时间对黄酮含量的影响

由图2可以看出，银杏叶在40 min时黄酮提取含量值较高，故最佳提取时间为40 min为宜。竹叶在40 min黄酮提取含量值达到最高，往后趋于下降，所以最佳提取时间为40 min最佳。杜仲叶在30 min～50 min黄酮提取含量值上升明显，60 min明显下降，故50 min为最佳。

（3）不同料液比对黄酮提取的影响 称取竹叶、银杏、杜仲叶粉末各5.000 g ，分别以1：16、1：18、1：20、1：22的不同料液比（g：mL ）在50 ℃ ，50 Hz超声波提取30 min。趁热旋蒸浓缩 ， 加石油醚萃取叶绿素，后用50%乙醇稀释定容至50 mL ，测定其吸光值 ，得黄酮含量与料液比之间的关系，实验结果见图3。

图3不同料液比对黄酮含量的影响

由图3可以看出银杏、竹叶、杜仲在1：18处黄酮含量值达到最大，往后或趋于平衡或下降，即在1：18为最佳提取料液比。

（4）不同温度比对黄酮提取的影响 称取竹叶、银杏、杜仲粉末各5.000 g ，分别在40 ℃、50 ℃、60 ℃、70 ℃下 ，以料液比为1：20（g：mL ），50 Hz 超声波超声提取30 min。趁热旋蒸浓缩 ， 加石油醚萃取叶绿素，后用50%乙醇稀释定容至50 mL ，测定其吸光值 ，得黄酮含量与温度之间的关系，实验结果见图4。

图4不同温度比对黄酮含量的影响

由图4可以看出，银杏叶提取黄酮含量的值随着温度升高而增大，到60 ℃后趋于平缓，故60 ℃为最佳提取温度。竹叶在50 ℃黄酮提取含量最高，往后随温度升高而下降，所以50 ℃为银杏最佳提取温度。杜仲黄酮提取含量随温度升高而增大，在60 ℃后增大不明显，杜仲的最佳提取温度为60 ℃～70 ℃。

2.2 正交试验设计

表1 银杏正交实验设计L9（34）及结果

编号No 因素

A 乙醇浓度（%） B 时间（min） C 料液比（g/mL） D 温度（℃） 黄酮含量 （%）

1 50（1） 30（1） 1：18（1） 50（1） 1.013

2 50（1） 40（2） 1：20（2） 60（2） 1.331

3 50（1） 50（3） 1：22（3） 70（3） 1.327

4 70（2） 30（1） 1：20（2） 70（3） 1.356

5 70（2） 40（2） 1：22（3） 50（1） 1.412

6 70（2） 50（3） 1：18（1） 60（2） 1.480

7 95（3） 30（1） 1：22（3） 60（2） 1.442

8 95（3） 40（2） 1：18（1） 70（3） 1.381

9 95（3） 50（3） 1：20（2） 50（1） 1.397

K1 1.224 1.270 1.291 1.274

K2 1.416 1.375 1.398 1.355

K3 1.300 1.401 1.394 1.418

极差（R） 0.192 0.131 0.107 0.144

优化方案 A2B3C2D3

因素排序 A D B C

注： 括号内数值为各因素的水平。

从极差分析结果可以得到，影响银杏叶黄酮提取含量的主次因素为：乙醇浓度>温度>超声时间>料液比，最佳提取工艺为A2B3C2D3，即70%乙醇，时间50 min，料液比1：20，温度70 ℃

表2 竹叶正交实验设计L9（34）及结果

编号No 因素

A 乙醇浓度（%） B 时间（min） C 料液比（g/mL） D 温度（℃） 黄酮含量 （%）

1 50（1） 30（1） 1：18（1） 40（1） 1.375

2 50（1） 40（2） 1：20（2） 50（2） 1.542

3 50（1） 50（3） 1：22（3） 60（3） 1.462

4 70（2） 30（1） 1：20（2） 60（3） 1.625

5 70（2） 40（2） 1：22（3） 40（1） 1.605

6 70（2） 50（3） 1：18（1） 50（2） 1.663

7 95（3） 30（1） 1：22（3） 50（2） 1.482

8 95（3） 40（2） 1：18（1） 60（3） 1.473

9 95（3） 50（3） 1：20（2） 40（1） 1.334

K1 1.456 1.494 1.504 1.438

K2 1.631 1.540 1.500 1.520

K3 1.430 1.486 1.516 1.562

极差（R） 0.201 0.054 0.016 0.124

优化方案 A2B2C3D3

因素排序 A D B C

注： 括号内数值为各因素的水平。

从极差分析结果可以得到，影响竹叶黄酮提取含量的主次因素为：乙醇浓度>温度>超声时间>料液比，最佳提取工艺为A2B2C3D3，即70%乙醇，时间40 min，料液比1：22，温度60 ℃。

表3 杜仲正交实验设计L9（34）及结果

编号No 因素

A 乙醇浓度（%） B 时间（min） C 料液比（g/mL） D 温度（℃） 黄酮含量 （%）

1 30（1） 40（1） 1：18（1） 50（1） 0.844

2 30（1） 50（2） 1：20（2） 60（2） 0.732

3 30（1） 60（3） 1：22（3） 70（3） 0.961

4 50（2） 40（1） 1：20（2） 70（3） 1.373

5 50（2） 50（2） 1：22（3） 50（1） 1.347

6 50（2） 60（3） 1：18（1） 60（2） 1.289

7 70（3） 40（1） 1：22（3） 60（2） 1.147

8 70（3） 50（2） 1：18（1） 70（3） 1.262

9 70（3） 60（3） 1：20（2） 50（1） 0.912

K1 0.845 1.121 1.132 1.034

K2 1.336 1.114 1.006 1.199

K3 1.107 1.054 1.152 1.056

极差（R） 0.491 0.067 0.146 0.165

优化方案 A2B1C3D2

因素排序 A D C B

注： 括号内数值为各因素的水平。

从极差分析结果可以得到，影响杜仲叶黄酮提取含量的主次因素为：乙醇浓度>温度>超声时间>料液比，最佳提取工艺为A2B1C3D2，即50%乙醇，时间40 min，料液比1：22，温度60 ℃。

2.3 重复性实验

为了验证优化提取条件的可靠性，对银杏叶、竹叶、杜仲叶分别选其上述最优工艺下重复提取3次，其总黄酮的平均提取含量（%）分别为1.532、1.847、1.462 ，与前面的微波提取法、索氏提取法比较，优于两者的提取效果。

2.4 提取方法比较

按照研究后的超声优化提取工艺与传统的索氏提取法跟新型的微波提取方法作比较，结果见下表4。

表4 不同提取方法对不同植物提取效果比较

项目 黄酮含量（%）

银杏 竹叶 杜仲

超声波提取法 1.532 1.847 1.462

微波提取法 0.866 0.660 1.165

索氏提取法 0.746 0.497 0.629

由表可以看出，按照该研究的优化工艺进行提取较传统的提取方法提取黄酮的含量高，不同植物用不同方法所提取的黄酮含量不同，而不同方法的不同条件对黄酮提取也有很大影响。此外，新型的提取方法比传统的提取方法还具有简便、省时、产率高等优点。

3 结语

通过对三种植物叶黄酮提取方法的研究，超声波提取法与索氏提取法和微波提取方法相对比，得出三中植物叶中提取黄酮含量最高的方法为超声波提取法，其最佳提取工艺分别为，银杏：70%乙醇，时间50 min，料液比1：20，温度70 ℃。竹叶：70%乙醇，时间40 min，料液比1：22，温度60 ℃。杜仲：50%乙醇，时间40 min，料液比1：22，温度60 ℃。确定了不同植物中黄酮提取含量的最高的植物为竹叶。

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