天冬总皂苷的超声提取工艺优化

刘　亮，丁丽娜，陈东林，冯　华，周英信

（1.遵义医药高等专科学校，贵州，遵义 563002； 2.遵义市药品检验所，贵州，遵义　563000）

天冬总皂苷的超声提取工艺优化

*刘亮1，丁丽娜1，陈东林1，冯华2，周英信1

（1.遵义医药高等专科学校，贵州，遵义 563002； 2.遵义市药品检验所，贵州，遵义563000）

目的探讨天冬总皂苷含量的测定方法，优化超声提取工艺。方法以菝葜皂苷元为对照品，采用紫外分光光度法测定总皂苷的含量，用单因素实验和正交实验优化超声提取工艺。结果菝葜皂苷元质量浓度在5.2～52 μg/mL之间线性关系良好（r = 0.9994），总皂苷平均回收率达到98.83%（RSD = 1.88%）。最佳超声提取工艺为乙醇浓度50%、料液比1:20（g/mL）、提取温度60 ℃、提取时间20 min。结论总皂苷含量测定方法简单、易行、准确，超声提取工艺高效、快捷，易于推广。

天冬；总皂苷；超声提取

天冬为百合科植物天门冬［Asparagus cochinchinensis（Lour.）Merr.］的块根，是一种临床常用中药，具有养阴清热，润肺滋肾的功效，临床上多用于治阴虚发热、咳嗽吐血、肺痈、咽喉肿痛、消渴、便秘等病症。通过文献查阅，笔者发现天冬中含有多种甾体皂苷类、糖类、氨基酸类、还含有甾醇类、强心苷类及丰富的维生素等成分［1-2］，其中甾体皂苷是天冬中所含有的一类重要活性成分，该类成分的药理学研究目前主要有抗氧化、抗衰老、清除自由基、抗血小板凝聚等方面［3-4］。目前对其多糖、氨基酸提取工艺方面研究较少［5-6］，对皂苷提取工艺研究更少［7］，难以进行深入开发。本实验以总皂苷含量为指标，对天冬超声提取工艺进行优化，以期为制定天冬药材质量标准和进一步开发利用提供依据。

1　材料与方法

1.1材料与仪器

天冬药材采集于贵州遵义，经遵义医药高等专科学校张学愈副教授鉴定为百合科植物天门冬［Asparagus cochinchinensis（Lour.）Merr.］的块根；菝葜皂苷元对照品购于上海圻明生物科技有限公司（批号：126-19-2）；所用水为高纯水，其它试剂均为分析纯。

JBT/C-YCL400T/3P（D） 型超声波药品处理机（济宁金百特工程机械有限公司）；Aquelix 5型实验室高纯水系统（重庆市金富科技发展有限公司）；UV2501紫外分光光度计（日本岛津公司）；Senco R系列旋转蒸发仪（上海申生科技有限公司）；FY130型药物粉碎机（天津市泰斯特仪器有限公司）；FA2004B型电子天平（上海越平科学仪器有限公司）。

1.2实验方法

1.2.1天冬总皂苷的含量测定

1.2.1.1供试品溶液的制备

称取天冬药材粗粉5 g，置于100 mL具塞锥形瓶中，加入一定量的乙醇溶液，超声提取（28 kHz，150 W），过滤，滤液转移至100 mL容量瓶中加水稀释至刻度，摇匀。准确吸取10 mL于分液漏斗中，用水饱合正丁醇分3次萃取，每次15 mL，正丁醇萃取液再用正丁醇饱和的水20 mL萃取后，减压回收正丁醇至干，残渣用甲醇溶解并定容于25 mL容量瓶中，作为供试品溶液。

1.2.1.2对照品溶液的制备

精密称取菝葜皂苷元对照品7.8 mg，置于25 mL容量瓶中，加甲醇溶解并定容至刻度，摇匀，作为对照品溶液。

1.2.1.3测定波长的确定

分别精密吸取对照品溶液0.3 mL、供试品溶液1.2 mL置于15 mL具塞试管中，挥干甲醇，再分别加入5%的香草醛-冰醋酸溶液0.2 mL和高氯酸0.8 mL，摇匀，密塞，60 ℃水浴显色15 min，取出后立即用冰水冷却5 min，再加入5 mL冰醋酸稀释，摇匀，静置10 min，在400～800 nm进行扫描，选择最大吸收波长为测定波长［8］。

1.2.1.4标准曲线的绘制

分别精密移取菝葜皂苷元对照品溶液0.0、0.1、0.2、0.4、0.6、0.8、1.0 mL置于15 mL具塞试管内，挥干甲醇，按1.2.1.3项下的操作方法显色，于455 nm处测定其吸光度。以吸光度（A）为纵坐标，质量浓度（C）为横坐标，绘制标准曲线。

1.2.2 超声提取单因素实验设计

影响天冬皂苷超声提取的因素很多，如提取功率、提取温度、提取时间、溶剂浓度、溶剂倍量等。在查阅文献［9-14］的基础上，本实验以乙醇作为提取溶剂，选取乙醇浓度（40%、50%、60%、70%、80%、90%） 、料液比（ 1:5、1:10、1:15、1:20、1:25、1:30 g/mL） 、提取温度（ 30、40、50、60、70、80℃）和提取时间（ 10、20、30、40、50、60 min） 4因素6水平进行实验，考察不同因素对天冬皂苷提取含量的影响，并筛选各因素的3个最佳水平。

1.2.3超声提取正交实验设计

根据单因素实验结果，称取天冬药材粗粉，按L9（34）正交因素水平表进行实验（表1），以优化天冬皂苷的提取条件。应用最佳的超声提取工艺测定天冬中的皂苷，重复3次，以验证本工艺的准确性。

表1　正交实验因素水平表Table 1　The factors and levels for the orthogonal design

2　结果

2.1 总皂苷含量测定

2.1.1测定波长

扫描图谱显示对照品在455 nm处有较大吸收峰（图1），而样品在455 nm处有最大吸收峰（图2），故选择455 nm为测定波长。

图1　对照品溶液吸收曲线Fig.1　Absorption curve of standard solution

图2　供试品溶液吸收曲线Fig.2　Absorption curve of test solution

2.1.2 标准曲线的绘制

由标准曲线（图3）计算出回归曲线方程为A = 0.01169C+0.03056，r = 0.9994。表明对照品菝葜皂苷元质量浓度在5.2～52 μg/mL与吸光度呈良好线性关系。

图3　菝葜皂苷元的标准曲线Fig.3　Standard curve of sarsasapogenin

2.1.3总皂苷含量测定方法学考察

2.1.3.1精密度实验

精密吸取对照液0.8 mL，共6份，按1.2.1.3项下的操作方法显色，于455 nm处测定吸光度，结果RSD为0.50%，表明方法的精密度良好。

2.1.3.2稳定性实验

分别精密吸取对照品溶液0.3 mL、供试品溶液0.6 mL，按1.2.1.3项下的操作方法显色，于455 nm处分别在0、10、20、30、60、90、120 min测定吸光度，结果表明对照液及供试液显色后在120 min内稳定，RSD分别为1.02%，1.42%。

2.1.3.3重复性实验

精密称取同一批样品5 g，共6份，按1.2.1.1及1.2.1.3项下的操作方法显色，于455 nm处测定吸光度，并计算含量，结果平均含量为0.90 %，RSD为0.73 %，表明方法的重复性良好。

2.1.3.4加标回收率实验

精密吸取已知含量的样品溶液0.6 mL于具塞试管中，共6份，分别加入对照品溶液0.3 mL，按1.2.1.3项下的操作方法显色，于455 nm处测定吸光度，计算加标回收率。结果总皂苷平均回收率为98.83%，RSD为1.88%。

2.2超声提取单因素实验结果

2.2.1乙醇浓度的影响

由图4可知（提取温度60℃、时间30 min、料液比1:20），乙醇浓度在40%～90% 范围内，天冬皂苷的提取量随乙醇浓度的增加呈先增加后减少的趋势。根据相似相容原理，随着乙醇浓度的增加，当其极性越接近于天冬皂苷的极性时，有利于提取，当乙醇浓度增加到50 % 时，皂苷提取量即达到最高。其中以40%～60% 的乙醇溶液提取的皂苷含量相对较高，因此选择乙醇浓度40 %、50 %、60 %作为正交实验的3水平。

2.2.2料液比的影响

图4　乙醇浓度对总皂苷含量的影响Fig.4　Effect of ethanol concentration on the extraction of total saponins

由图5可知（提取温度60 ℃、时间30 min、乙醇浓度50 %），当料液比为1:15（g/mL）以上后总皂苷提取量基本无变化，说明提取已达到平衡状态。从提取率和成本等方面考虑，乙醇的用量不宜过大，因此选取料液比为1:10、1:15、1:20（g/mL）作为正交实验的3水平。

图5　料液比对总皂苷含量的影响Fig.5　Effect of solid-to-liquid ratio on the extraction of total saponins

2.2.3 提取温度的影响

由图6可知（提取时间30 min、料液比1:15、乙醇浓度50%），提取温度在30～50 ℃范围内，皂苷提取量随温度的升高而明显增加；在50～80 ℃范围内，皂苷提取量逐渐下降，说明温度过低或过高均不利用皂苷的提取。因此选择40 ℃、50 ℃、60 ℃作为正交实验的3水平。

图6　提取温度对总皂苷含量的影响Fig.6　Effect of temperature on extraction content of total saponins

2.2.4 提取时间的影响

由图7可知（提取温度50 ℃、料液比1:15、乙醇浓度50%），在15～20 min范围内，皂苷提取量随时间的延长而显著增加；当提取时间超过20 min之后，提取含量极缓慢下降，说明提取已达到平衡状态。因此选择10、20、30 min作为正交实验的3水平。

图7　提取时间对总皂苷含量的影响Fig.7　Effect of time on extraction content of total saponins

2.3 超声提取正交实验

根据单因素实验结果，可以基本确定天冬皂苷超声提取时乙醇浓度、料液比、提取时间和提取温度的合理范围，在此基础上设计正交实验，以确定其超声提取的最佳工艺。正交实验结果及分析见表2和表3。

表2　正交实验结果Table 2　Results of reciprocal orthogonal test

表3　方差分析Table 3　Variance analyses

由表2 、表3 可见，乙醇浓度对实验结果具有显著性影响（P ＜ 0.05），影响因素主次顺序为D ＞B ＞ C ＞ A，最优工艺为A3B2C3D2，即超声提取的最佳工艺为乙醇浓度50%、料液比1:20（g/mL）、提取温度60 ℃、提取时间20 min。按照正交实验得出的最佳提取工艺做3次重复实验，天冬总皂苷含量平均值为0.94 %，RSD 为0.52 %。

3　讨论

皂苷分子结构中无共轭双键，在紫外可见光区无特征性吸收峰，可以利用显色反应后在可见光范围产生特征性吸收峰。根据前期文献的研究，结合紫外法的显色特点，实验以菝葜皂苷元为对照品，采用香草醛-高氯酸法显色，对天冬中总皂苷的含量测定进行了方法学考察，显色过程中应严格控制温度和时间。

超声提取方法的原理是利用超声波的机械作用、空化作用等达到植物细胞的破碎，加速有效成分的溶出、扩散，具有省时、节能、操作简便等优点。从理论上考虑，提取时间越长、温度越高，总皂苷得率应越高，但单因素实验结果不支持该观点，可能是因为提取时间过长、温度过高、超声强化作用增加了杂质的溶出，从而导致总皂苷溶解量减少。总皂苷的纯化先利用其在含水正丁醇中溶解度较大的性质进行萃取，进而用水萃取除去水溶性的杂质，可以得到纯化的总皂苷。由于皂苷具有很强的发泡性，故在浓缩过程中应时刻注意，避免浓缩液冲出，影响实验结果的准确性。本实验通过单因素实验及正交实验优选天冬超声提取工艺，单因素实验分别考察了乙醇浓度、料液比、提取时间、提取温度对皂苷提取效果的影响，根据单因素实验结果，选择4因素3水平进行正交实验，研究结果表明只有乙醇浓度对总皂苷的含量有显著性影响，影响因素主次顺序为D ＞ B ＞ C ＞ A，最佳工艺为A3B2C3D2，即超声提取的最佳工艺为乙醇浓度50%、料液比1:20（g/mL）、提取温度60 ℃、提取时间20 min。实验之初对天冬总皂苷回流提取法进行了研究，回流提取工艺为提取时间1.5 h、乙醇倍数8倍、乙醇浓度70%、提取次数3次，含量可达到1.12%，略高于超声法，但超声法提取快速高效的优势是回流法无法比拟的。依照超声法最佳提取工艺做3次重复实验，天冬总皂苷提取含量平均值0.94 %（已对此数据进行核实，确为天冬总皂苷的含量，与参考文献7比较要低些，但显色方法及测量波长不一样，所以总皂苷的含量就不一样），RSD为0.52 %。验证实验证实，优化后的工艺路线稳定可行，操作简便，节省时间和溶剂，可为天冬的生产应用提供可靠的理论依据和参考。

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ULTRASONIC EXTRACTION OPTIMIZATION OF TOTAL SAPONINS FROM ASPARAGUS COCHINCHINENSIS （LOUR.） MERR.

*LIU Liang1， DING Li-na1， CHEN Dong-lin1， FENG Hua2， ZHOU Ying-xin1

（1.Zunyi Medical and Pharmaceutical College， Zunyi， Guizhou 563002， China；2.Zunyi Institute for Drug Control， Zunyi， Guizhou 563000， China）

Objective: To develop a method for determining the content of total saponins in Asparagus cochinchinensis and optimize its ultrasonic extraction process.Methods: Sarsasapogenin as the control sample，the content of total saponins was determined by ultraviolet spectrophotometry.Optimization of the ultrasonic extraction process of total saponins was performed using single factor and orthogonal array design methods.Results: The calibration curve of the sarsasapogenin was linear （r = 0.9994） in the range of 5.2～52 μg/mL with average spike recovery of 98.83% （RSD = 1.88%）.The optimum ultrasonic extraction conditions were found to be: ethanol concentration of 50%， solid-to-liquid ratio of 1:20， extraction temperature of 60℃， ultrasonic extraction duration of 20 minutes.Conclusion: The developed method for total saponins determination is simple， feasible and accurate.The optimized extraction process is efficient and quick， and easy to popularize.

Asparagus cochinchinensis； total saponins； ultrasonic extraction

R284.2

ADOI:10.3969/j.issn.1674-8085.2015.02.020

1674-8085（2015）02-0081-06

2015-01-09；修改日期：2015-03-01

遵义市科技局、遵义医药高等专科学校联合科技计划项目（遵市科合社字【2013】24号）；遵义市汇川区科技计划项目。作者简介：*刘亮（1981-），男，重庆万州人，副教授，主要从事中药、民族药化学成分及质量研究（E-mail:jikman1@163.com）；

丁丽娜（1981-），女，贵州遵义人，讲师，主要从事天然药物化学成分及质量研究（E-mail:lifewaterdln0681@qq.com）；

陈东林（1961-），女，贵州遵义人，教授，主要从事蔬菜化肥、农药含量（E-mail:1064618089@qq.com）；

冯华（1978-），男，贵州遵义人，主管药师，主要从事新药研究及药品检验（E-mail:fenghua781014@yahoo.com.cn）；

周英信（1962-），男，贵州遵义人，教授，主要从事脾胃病证治研究（E-mail:E-mail:1487476788@qq.com）.