RNA干扰技术的研究及进展

荣晶晶 和姬苓

【摘要】RNA干扰是近几年兴起的一种新技术，它是由双链核糖核酸引起的抑制基因表达的一种现象。这种新技术在抗病毒、抗癌症和基因病等医学领域表现出了广阔的应用前景。本文就RNA干扰的作用机制 、研究进展进行综述。

【关键词】RNA干扰技术 基因沉默 研究进展

【中图分类号】R9145 【文獻标识码】B【文章编号】1004-4949（2015）03-0645-01

RNA 干扰（RNA interference，RNAi）是近年来发现的一种高效特异地阻断基因表达的新技术。RNAi 是指一些小的双链 RNA（dsRNA）在细胞内 Dicer 内切酶的识别、结合、酶切下，产生有活性的长度为 21～23nt 干扰性 RNA（short interfering RNA ，siRNA），与互补的目的基因的 mRNA 结合并使之降解，从而到达抑制目的基因表达的作用，是一种由双链 RNA诱发的“基因沉默”现象。本文旨在讲述RNA干扰的作用机制及研究进展。

1. RNA干扰技术的作用机制

RNAi是指细胞中导入与内源性mRNA编码区某段序列同源的双链 RNA （double—stranded RNA，dsRNA）片段，可致该mRNA发生特异性降解从而导致基因表达沉默的现象[1]。其作用机制是：外源性 （如病毒）或内源性的dsRNA在细胞内与一种具有dsRNA特异性的RNA酶Ⅲ内切核酸酶 （RNaseUIendnuclease）——Dicer结合为酶dsRNA复合物 ，随即被切割成21～23nt的RNA片段 ，即siRNA。siRNA与 Dicer形成 RISC。siRNA 作为引导序列，按照碱基互补原则识别靶基因转录出的mRNA，并引导RISC复合体结合mRNA.随后siRNA与mRNA在复合体中换位，核酸酶 Dicer将mRNA切割成21～23nt的片段 ，从而可以破坏特定目的基因转录产生的mRNA，使其功能沉默，即基因沉默（gene silencing）。而新产生的siRNA片段可再次与Dicer酶形成RISC复合体 ，介导新一轮的同源mRNA降解 ，从而产生级联放大效应 ，显著增强了抑制基因表达的作用

2. RNA干扰技术的临床应用与进展

2.1抗肿瘤治疗

2.1.1白血病的治疗 化疗在恶性肿瘤的治疗中具有重要地位。很多学者致力于利用RNA干扰技术治疗肿瘤，以解决多重耐药性导致化疗失败的问题。例如，w0hlbold等[2]构建了针对bcr—abl融合位点 b3a2的同源siRNA，研究结果表明特异性siRNA可以使过表达 bcr—abl蛋白的细胞系（32Dp2102wt，M07P210，CD34 十 2CML细胞 ）的bcr—abl蛋白形成组显著下降，并且长期用这种特异性 siRNA可以逆转 bcr—abl蛋白依赖性的细胞循环调节作用而且可以选择性地抑制细胞生长，为进一步探索慢性粒细胞白血病治疗的新途径提供了有利的实验依据。

2.1.2治疗乳腺癌 乳腺癌细胞在体内具有不受控增殖性，有研究表明利用RNA干扰技术抑制可能导致乳腺癌的基因从而达到控制乳腺癌细胞的增殖，Jiang等[3]通过构建靶向 MTA1 （ metastasis associate d-1）的短发夹RNA（ short hairpin RNA，shRNA） 并导入ER（ +） MCF-7 和 ER（ -） MDA-MB-231 乳腺癌细胞。MTA1 下调后 ER（ -） MDA-MB-231 细胞重新表达 ERα，增加了内分泌治疗的敏感性。同时降低基质金属蛋白酶-9 （ matrix metalloproteinase-9，MMP-9） 和 cyclin D1 的蛋白表达水平，使MDA-MB-231 细胞阻滞在G0/ G1期，但对MCF-7 细胞的细胞周期无明显影响。靶向 MTA1 沉默能明显引起两种乳腺癌细胞增殖和转移抑制，RNA 靶向干扰 MTA1 基因可能具有乳腺癌治疗效用。 Qiu等 [4]实验研究表明，利用 siRNA的方法靶向沉默 cripto一1基因的表达可在一定程度上抑制人乳腺癌MDA—MB468细胞的侵袭，进而抑制肿瘤的进一步发展。另外，乳腺癌50% 的首发性和 80% 的复发性转移发生在骨骼中，Guo等提出靶向 BMP4 信号通路将成为乳腺癌治疗的新手段，实验中通过成功构建靶向BMP4的siRNA并导入MCF-7 和MBA-MD-231细胞中，抑制了癌细胞的侵袭和转移，证明了 BMP4 在乳腺癌细胞中的作用； 同时发现 MMP-1 和 CXCR4 的表达在 BMP4过表达的细胞中激增。

2.1.3其他肿瘤 肿瘤细胞可持续增殖，Zhou等[5]利用腺病毒介导的 RNAi转染人食管鳞状细胞癌细胞 Hecl能抑制腺癌肿瘤的生长和增殖并使其失去致瘤性。应用慢病毒介导的RNA干扰技术将Akt1沉默，并成功转入胃癌细胞株SGC-7901和BGC-823， 结果也发现， Akt1沉默在体外和体内环境下均可显著抑制胃癌细胞增殖并诱导细胞凋亡。钟英强等研究发现，siRNA靶向沉默 hTERT基因的表达，可在一定程度上抑制人胰腺癌 Capan-2细胞 Bcl-2、环氧化酶 2基因的表达，从而抑制肿瘤进一步恶化[6]。在前列腺癌研究领域中，金鹏等[7]已率先采用RNA干扰技术， 将针对GSTP1设计的短发卡RNA转染人前列腺癌细胞株Du145介导GSTP1基因沉默， 发现能明显抑制癌细胞增殖。

2.2抗感染

RNA技术同样可以用于病毒、寄生虫甚至细菌引起的感染性疾病中，尤其是对抗病毒情有独钟，起初是在植物中发现 RNAi的抗病毒作用，后来在动物中也发现相同的作用。近几年RNA干扰机制在抗病毒感染的研究中取得了很大进展。在病毒复制时，tat基因转录所必需的周期蛋白（cyclin）T1能够显著提高病毒基因表达水平。通过 RNAi的方法设计抑制 cyclinT1的表达 ，从而达到抑制病毒复制的目的。Deng等科学家致力于这方面的研究，最后的研究结果表明shRNA能够阻断乙型肝炎病毒DNA的表达与复制[8]。

2.3心脑血管疾病

2.3.心血管病 高血压是最常见的心血管病，张敬群等[9]通过构建两肾一夹高血压大鼠模型用携带U6启动子和血管紧张素1受体短发夹RNA编码序列的质粒干扰AT1a受体，结果证实可有效抑制肾血管性高血压进展。在心肌病及心力衰竭的研究也有一定进展，李凡东等[10]通过RNA干扰IK1表达，使其电流幅度明显下降，有利的抑制了心机细胞IK1，為治疗心肌病提供了新的方法。Watanabe等[11]将肌浆网Ca2+ATP酶（SERCA2a）的RNA转染入新生小鼠心肌细胞，通过证实SERCA2a的mRNA和蛋白水平显著下降，而钙离子的吸收明显提高。杨广等[12]也在实验中进一步验证了RNA可干扰心衰大鼠受磷蛋白mRNA的表达，改善心脏功能。

2.3.2脑血管病 2. 脑血管疾病致残率、致死率极高，治疗脑血管病成为了又一个研究重点。基因靶点治疗主要体现在动脉粥样硬化方面。脂蛋白脂肪酶（LPL）在动脉粥样硬化中的机制不完全清楚，因此脂蛋白脂肪酶成为治疗动脉硬化的突破口。刘明等[13]利用 RNAi 技术在细胞水平抑制LPL 基因的表达，结果证实抑制率可达 70%以上。这一结果为以后控制和预防脑血管疾病提供了理论依据。洪涛等[14]应用 RNAi 技术沉默平滑肌细胞间隙连接蛋白 43（ connexin43，Cx43）的表达，从而抑制了细胞间的通讯。在此基础上，他们继续采腺病毒介导的RNAi特异干扰脑血管痉挛 Cx43 的异常高表达，进一步证实 Cx43 及缝隙连接在脑血管痉挛发生、发展中的重要作用，也为探讨脑血管疾病的基因治疗做出贡献。

2.4其他

还可用于遗传病的研究中， RNAi在基因功能和相关方面的研究中具有许多传统方法无法比拟的优势 ，因此许多遗传学家和分子生物学家对此产生了极大兴趣，RNA干扰技术成为了遗传学研究的新方法。实验研究发现，在体内siRNA能够直接作用于点突变的基因使其功能丧失降低突变，野生型基因却不受影响，因为点突变引发的遗传性疾病能够通过应用 RNAi技术降低突变方法进行治疗。例如 ，遗传性神经系统退化性疾病Huntington病和 Alzheimer病的治疗就可以通过RNAi技术，即在脑部局部注射siRNA进行基因治疗；再如应用 RNAi技术治疗常染色体显性色素性视网膜炎 （adRP）的转基因小鼠，取得了良好的效果。

3.研究进展

siRNA 的这种非特异性反应和 RNA 传递效率极大地影响着它的体内应用，但进一步合理设计高效 siRNA 序列、开发在体内具有长效功能的载体、完善更为特异性的体内输送途径等将成为进一步促进 RNAi 作为疾病治疗策略的研究热点。随着 RNAi 机理的进一步阐明，RNAi 技术将以惊人的速度向前发展，不断取得突破，联合多基因 RNAi 治疗也将为基因治疗开辟更广阔的前景。总之，随着RNA干扰机制研究的深入和完善，应用RNA干扰技术，必将大力推动人类疾病的治疗和人类功能基因组学的发展。

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