TGF—β1基因在人椎间盘髓核的表达陈思进

杨欣建

【摘要】目的：研究在正常人的椎间盘与退变的椎间盘髓核细胞中TGF-β1基因是否表达，表达含量的差异，探讨这些基因表达量的高低与退变椎间盘的关系。方法：利用实时荧光定量PCR（qRT-PCR）法检测TGF-β1基因在正常人与退变椎间盘髓核细胞中的表达含量。结果：TGF-β1在退变的椎间盘细胞表达较正常椎间盘升高，有一定丰度。结论：TGF-β1基因在人椎间盘中表达。人退变的的椎间盘与TGF-β1高表达相关。

【关键词】椎间盘退变；转化因子-β1；基因

【中图分类号】R681.5 【文献标识码】B【文章编号】1004-4949（2015）02-0274-02

椎间盘退变为脊柱外科常见疾病之一，临床上约20%的下腰痛由椎间盘退变引起[1]，已成为临床腰痛的主要原因。引起椎间盘退变的原因仍不明确，目前学说主要以基因学说[2]、细胞因子学说[3]等。基因学说已成为近年来研究热点，其中尤以转化因子-β1（TGF-β1）基因为学者所热衷。TGF-β1为TGF-β家族中的一种亚群，有研究表明，TGF-β家族基因具有调节细胞增殖与分化、细胞凋亡、迁移和黏连等广泛功能[4]。TFG-β1是否在退变椎间盘中表达，与椎间盘退变是否有内在联系，至今仍未研究清楚。本文拟行实时荧光定量（qRT-PCR）研究TFG-β1基因与椎间盘退变的表达与相互关系，探讨引发椎间盘退变的可能原因。

1、 材料与方法

1.1 实验标本来源 标本均收集自深圳市二医院脊柱外科2013年1月至2014年9月行腰椎后路髓核摘除+椎间融合+内固定植骨融合术的患者。按照术前椎间盘退变的影像学资料，即为 MRIT2加权像Pfirrmann的标准[5]加术后病理切片结果分为实验组与对照组。实验组为腰椎间盘突出症、术前椎间盘MRI Pfirrmann分级为IV级，术后病理结果提示椎间盘髓核退变的患者16例，其中男性10例，女性6例，平均年龄（47.5±12.1岁），对照组为腰椎爆裂骨折脱位，术前椎间盘MRIT2椎间盘信号正常，术后病理为正常椎间盘组织，需摘取椎间盘融合的患者，共8例，其中男性5例，女性3例，平均年龄（43.6±13.2岁）。

1.2 标本处理 在术中取出椎间盘后，立即用生理盐水反复冲洗干净，后放置于标本袋中，加入RNA固定液，冰冻于-80℃冰箱保存备用

1.3实验方法

1.31 Trizol提取总RNA

取100mg的组织样，在液氮中研磨，充分研磨后移至预加了1ml TRIzol试剂（LifeTechnologies公司）的EP管中，按相关说明书加入试剂，并跑胶，相关引物如下：h-TGFB1-QPCR-F：5-GAGAAGCGGTACCTGAACCC-3；h-TGFB1-QPCR-R： 5-GGCGAAAGCCCTCAATTTCC-3。

1.32 RNA反转录

使用TOYOBO公司Rever-Tra-Ace-α-试剂盒进行反转录，使用Random与Oligo（dT）20混合引物。按说明书操作，随机引物反转，反应完成后放置负20℃冰箱保存。

1.33定量PCR检测 使用SYBR Green染料进行荧光定量PCR检测。

1.4统计学处理

应用spss 13.0統计软件进行数据处理， 各组数据均采用 x± s表示，采用 χ2 检验；标准均数间比较，采用独立样本t检验进行统计分析。

2、实验结果

2.1组别特征：实验组平均年龄47.5±12.1岁，对照组平均年龄43.6±13.2岁，经t检验，发现两组年龄无差异（p>0.05）。

2.2实验组TGF-β1基因在退变椎间盘及正常椎间盘均表达。在退变椎间盘中表达含量较高，在正常椎间盘组织中，表达含量较低。其绝对定量分别为：实验组X±s： 8.61±1.28，，对照组为X±s：1.00±0.09，与对照组比较，p<0.05，具有统计学意义。

3、讨论

TGF-β1基因是一类细胞生长因子调控基因，在全身多个组织中均可表达，调控着细胞的分化、免疫、代谢、凋亡等功能。 TGF-β1基因为TFG-β超家族的一员，分子量约为25kD，其存在多个基因的多态性情况，这些基因的多态性直接影响着 TGF-β1在机体中的功能情况。

对于椎间盘退变的机制仍未研究透彻，有研究显示，TGF-β1基因在椎间盘中过度表达可促使椎间盘髓核细胞进一步纤维化，从而加重椎间盘退变[6]。本实验中，退变组TGF-β1的mRNA表达量明显高于正常椎间盘TGF-β1mRNA含量，与之研究理论相符合。同时有学者发现，TGF-β1基因的过度表达，可直接导致椎间盘I型与III型胶原的增加，改变了椎间盘组织的内环境稳态，引发退变，TGF-β1基因过度表达被认为与人退变椎间盘高度相关。[7]

于此同时，有学者研究表明少量TGF-B1的表达，通过其生理调节作用，对椎间盘具有保护效益，使纤维环外层I型胶原含量聚集，Ⅲ型胶原则主要分布于纤维环细胞周围，加强了椎间盘稳定性，减少椎间盘退变的几率。[8]本实验中，正常椎间盘组中亦有少量TGF-β1的mRNA表达，属于其基础含量表达，这表明TGF-β1的少量表达在髓核中维持着椎间盘的稳定，避免其进一步退化。

总而言之，TGF-β1在椎间盘不同时期发挥不同作用的特点，早期基础量的TGF-β1对椎间盘起着保护作用，至严重退变期，TGF-β1的过表达与退变高度相关。目前TGF-β1基因调控的具体细胞信号通路，与椎间盘内环境、外在环境的相关影响关系仍未研究清楚，值得进一步的研究。

参考文献

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[2] 白跃宏，俞红。腰椎间盘退变分子遗传学研究进展及转换医学应用[J]；转化医学杂志 2012，10（1）：104-110.

[3] Li Gao-feng，Zhang Shao-kun；Research of cytokines and gene therapy for intervertebral disc degeneration[J].Journal of Clinical Rehabilitative Tissue Engineering research，2009，2（13）：359-362.

[4]Zhao Jian，Jia Lian-Shun.Adenovirus-mediated TGF-B1 gene transfer to human degenerative lumbar intervertebral disc cells[J].Chinese Medical Journal 2002；115（3）：409-412.

[5]Pfirrmann CW，M etzdorf A ，Zanetti M， et a1 . Magnetic resonance.classification of lumbar intervertebral disc degeneration [J ] .Spine ，200 1 ，26 （17 ） ：1873 —1 878 .

[6]Yanagita M. Inhibitors/antagonists of TFG-β system in kidney fibrosis[J].Nephrol Dial Transplant，2012，27（10）：3686-3691

[7]Bi Y，Gao B，Patel A.Patel A Evidence—based medication use among Chinese patients with acute coronary syndromes at the time of hospital discharge and 1 year after hospitalalization：results from the Clinical Pathnays for Acute Coronary Syndromes in China（CPACS）study 2009[J].JAMA，2009，313（10）：2015-2020

[8]李永民，趙静等，NF-kB、TGF-B1在退变椎间盘组织中的表达及意义.[J]山东医药，2007，47（29）：13-14.