定量蛋白质组学分析链霉素耐药和敏感结核分枝杆菌临床

分离株　孙艳蕾

【摘要】目的：研究分析敏感结核分枝杆菌链霉素耐药相关的潜在菌体蛋白。方法：通过使用结核分枝杆菌临床分析链霉素敏感株05和结核分枝杆菌H37Rv，并以其为对照，使用iTRAQ技术和生物信息学对结核分枝杆菌临床分离株链霉素耐药株08菌体蛋白进行鉴定和定量分析，并通过WeGo功能注释聚类分析菌株的差异表达蛋白细胞组分和分析的功能以及其生物进程等内容。结果：08菌株分别与05菌株和H37Rv菌株比较差异表达为196个和138个，其中共同差异表达蛋白为119个。其中差异表达蛋白理论相对分子量的分布比较广，其生物进程主要参与在中间代谢、脂质代谢以及呼吸作用中，其分子功能主要是催化活性和结合功能。其中共同差异表达蛋白分别为：8个核糖体蛋白在08菌株中表達下调、8个蛋白在08菌株中差异表达比较显著。结论：使用iTRAQ技术可以有效的发展链霉素耐药结核分枝杆菌相对于链霉素敏感结核分枝杆菌以及H37Rv菌株共同差异表达蛋白，可以为进一步研究结核分枝杆菌链霉素耐药机制提供一定的依据和条件。

【关键词】定量蛋白质组学分析；链霉素；耐药；敏感结核分枝杆菌；临床分离株

【中图分类号】93A 【文献标识码】B【文章编号】1004-4949（2015）02-0181-02

根据研究发现，在结核疾病中，主要是耐多药结核为主，因此，导致耐药结核病的诊断和治疗具有较大的困难。其中链霉素是一种氨基葡萄糖型的抗生素，对抗结核分枝杆菌具有一定的作用。目前针对结核病的治疗主要是依靠利福平、链霉素、异烟肼等联合化疗，但是链霉素耐药结核分枝杆菌普遍存在，导致在治疗方面具有严重的影响[1]。通过定量蛋白质组学分析，可以全面的定量分析差异表达蛋白，为鉴定蛋白提供了较好的方式和手段。本研究通过对链霉素耐药和敏感结核分枝杆菌临床分离株进行定量蛋白质组学分析，现报告如下。

1.材料与方法

1.1一般材料

其一，菌株。结核分枝杆菌临床分离链霉素敏感株05以及结核分枝杆菌临床分离链霉素耐药株08，用于抽提菌体蛋白的临床分离株和H37Rv菌株主要是由国家结核病参比实验室提供，菌体经钴 60 照射灭活之后，保存在零下80摄氏度中以便备用。

其二，主要试剂和仪器。iTRAQ标试剂盒、胰蛋白酶、定量试剂盒，另外还包括半制备型HPLC、强阳离子交换柱和C18反相色谱柱等。

1.2方法

1.2.1全菌体蛋白的提取措施

灭活之后的结核分枝杆菌通过30分钟洗涤，30分钟离心处理，使用30ml的裂解液悬浮沉淀，同时使用高压均质破碎仪器进行破菌处理，其中溶液的总体积要确保在50ml以内。通过四次循环破菌处理之后，再次进行30分钟离心处理，并取20ml上清，加入5ml50%的TCA / 丙酮，使用冰水淋浴2小时，离心30分钟之后使用零下20摄氏度的预冷丙酮洗涤沉淀物3次，并将其晾干处理。沉淀物就是菌体蛋白的样品，将其放置在零下80℃以便备用。

1.2.2全菌体蛋白复溶及定量

将部分沉淀物放置在1.5ml的离心管中，并加入复溶Buffer ，最终浓度为1mmol / L。乙二胺四乙酸的最终浓度为2 m mol / L。将其混合均匀之后放置5分钟，并加入二硫苏糖醇，使得其最终浓度为10 m mol / L。并使用超声助溶5分钟，离心处理25分钟，上清于56℃的水浴1小时之后取出，并迅速的加入碘乙酰胺，当最终浓度达到55-100 m mol / L之后，放置在暗室静置1小时。之后加入4倍体积的预冷丙酮，放置在零下20℃的环境中沉淀3小时。离心处理之后弃上清。并使用300μL 的0. 1% SDS 的溶液和50%TEAB进行复溶沉淀，超声助溶3分钟，使用定量检测总蛋白的提取量。

1.2.3蛋白质酶解

在每个样品中取出100μg 的蛋白，并且使用0. 1%的SDS 溶液和50%的TEAB溶液补齐相同的体积。在每100μg 蛋白质的样品中加入3.4μg 的胰蛋白酶，并放置在37摄氏度的水浴中，其放置时间为24小时。

1.2.4生物学分析

其中质谱数据通过相关软件自动分析标峰，得出相关文件，并下载结核分枝杆菌的数据，将其作为搜索数据库，通过搜索引擎进行本地搜索，对蛋白质鉴定进行评价打分。差异蛋白质的定量主要以搜库的结果为前提基础，根据软件的加权方式，将08菌株分别与05菌株和H37Rv菌株相比，直接显示相对定量结果，根据不同的鉴定次数进行分析研究，并通过WeGO功能注释聚类分析差异蛋白细胞的组分、分子功能以及生物的进程等情况。

2.结果

2.1菌株的特点

05菌株是北京基因型，对链霉素、异烟肼以及利福平等药物均具有一定的敏感想，08菌株是非北京基因型，只是对链霉素具有耐药性。05菌株和08菌株的毒性相似，并且均高于标准菌株H37Rv。

2.2菌体蛋白鉴定和相对定量

通过鉴定的蛋白质数据进行统计分析，共鉴定到659个蛋白质，其中有意义的定量蛋白质为327个。08菌株分别与05菌株和H37Rv菌株比较差异表达为196个和138个，其中共同差异表达蛋白为119个。其中差异表达蛋白理论相对分子量的分布比较广，其生物进程主要参与在中间代谢、脂质代谢以及呼吸作用中，其分子功能主要是催化活性功能和结合功能。其中共同差异表达蛋白分别为：8个核糖体蛋白在08菌株中表达下调、8个蛋白在08菌株中差异表达比较显著。

3.讨论

链霉素是一种抗结核药物，通常和结核分枝杆菌核糖体蛋白质量共同作用于结核病，以便达到抑制其蛋白质合成的目的，从而取得较好的治疗效果。本研究中通过使用iTRAQ技术对结核分枝杆菌进行分析研究，有效的克服了经典双向凝胶电池存在的低分辨率和低敏感性的缺点，可以在任何类型的蛋白质中进行鉴定，并且可以同时定量8个以上的样品，从而有效的缩小了不同样品和不同批次间的实验误差，具有较好的重复作用[2]。

本研究中通过iTRAQ技术对结核分枝杆菌临床分离链霉素耐药株08、链霉素05敏感株以及标准株H37Rv进行定量蛋白质组学分析研究，对链霉素耐药株08和链霉素05敏感株以及标准株H37Rv进行鉴定，共鉴定到共同差异表达蛋白119个，主要为代谢相关蛋白。

综上所述，使用iTRAQ技术可以有效的发展链霉素耐药结核分枝杆菌相对于链霉素敏感结核分枝杆菌以及H37Rv菌株共同差异表达蛋白，可以为进一步研究结核分枝杆菌链霉素耐药机制提供一定的依据和条件。

参考文献

[1]刘东.研究生蛋白质组学教学改革与实践[J].现代医药卫生，2013（3）：15.

[2]朱传智. 定量蛋白质组学分析链霉素耐药和敏感结核分枝杆菌临床分离株[J].微生物学报，2010（8）：147.