胶质细胞源性神经营养因子基因克隆及表达载体的构建

孙晓晨　孙磊磊　李小东

【摘要】 目的：克隆大鼠胶质细胞源性神经营养因子（GDNF）的全长基因，并构建真核细胞表达质粒。方法：运用已合成的GDNFcDNA，加入自行设计的引物扩增GDNF基因，并与质粒pEGFP-C3连接，构建表达质粒。结果：PCR扩增的目的基因为630bp，对构建的表达质粒双切酶电泳及测序证明基因片段为630bp。 结论：正确克隆了GDNF基因并成功构建表达质粒，为下一步进行载体介导的体内转基因奠定了基础。

【关键词】 胶质细胞源性神经营养因子； 载体； 克隆

【中图分类号】R562.21 【文献标识码】B【文章编号】1004-4949（2015）02-0101-01

胶质细胞源性神经营养因子（Glial cell line-derived neurotrophic factor，GDNF）是1993年Lin等从大鼠胶质瘤细胞B49中纯化获得的一种新型神经营养因子，化学结构为糖蛋白，并发现它具有促进多巴胺能神经元存活的功能[1] . Lin LFH，Doherty DH，Lile JD，et al.GDNF：a glial cell line-derived neurotrophic factor for midobrai dopaminergic neurons.[J].Science，1993，260（5111）：1130-1132]，后来进一步研究发现其对运功、感觉等多种神经元有营养作用。Oorschot等研究发现GDNF对培养的大鼠胚胎运动神经元存活具有重要作用，其效应分别是脑源性神经营养因子（BDNF）、睫状神经营养因子（CNTF）和人类胆碱能分泌因子-白血病抑制因子（CDF/LIF）的75倍，650倍，和2500倍[2] Oorschot DE，Mclennan IS.The trophic requirements of mature motoneurons.[J].Brain Res，1998，789（2）：315-321]，Annette等发现GDNF在胚胎期可以促进感觉神经元轴突的发育，在成熟期可以促进轴突的延长[3] Annette Markus，Tushar D，Patel，William D.Snider. Neurotrophic factors and axonal growth[J].Curr Opin Neurobiol，2002，12（5）：523-53]。由于其对神经的营养作用，目前被应用到脑缺血，帕金森病等的研究中。后来，在研究疼痛的过程中，发现其对神经源性疼痛具有强烈的镇痛与抑痛作用。但由于其在脑组织含量低，提取复杂，价格昂贵而限制了他的进一步引用。为此我们克隆了大鼠的GDNF基因，连于pcDNA3质粒，制备了带有目的基因的真核细胞表达质粒，为下一步研究载体介导的GDNF质粒的治疗作用打下基础。

1 材料和方法

1.1材料

1.1.1GDNFcDNA菌种与质粒

鼠GDNFcDNA及质粒pEGFP-C3购自北京泛基诺公司。大肠杆菌JM109由西安交通大学遗传学教研室提供。

1.1.2实验试剂

限制性内切酶BamHI，XhoI购自Promega，T4 DNA连接酶、T4DNA聚合酶、TaqDNA聚合酶及dNTPs均购自华美生物公司，DNA合成试剂盒、DNA回收试剂盒、质粒提取试剂盒购自上海生物工程公司。其他试剂为国产分析纯及西安交通大学医学院遗传学实验室自备。

1.2方法

1.2.1鼠GDNFcDNA的扩增

参照GeneBank和文献报道，设计上下游引物，上游：5'-AGGATCCATGAAGTTATGGGATGTCGT-3'，下游：5'-ACTCGAGTCAGATACATCCACACCGTT-3'。由上海生物工程公司代替合成。按PCR试剂盒说明书将无RNA酶水、dNTPs，5×buffer、已合成的上下游引物、25mmolMgSO4加入到置于冰上的0.2ml离心管中反应条件，混匀后加入T4 DNA连接酶、T4DNA聚合酶。震荡10秒混匀，放入PCR仪扩增目的基因。反应条件和反应体系如下：

样品于94℃变性5min，加入2U的Taq聚合酶，按下列参数循环30次：94℃变性30s，56℃退火30s，72℃延伸1min，最后一个循环72℃，延伸5min。

结束后扩增样品在0.8%琼脂糖凝胶电泳中检测扩增产物，用DNA marker判断扩增片段的大小。同时切出GDNFcDNA条带，用胶回收试剂盒予以回收纯化。

1.2.2构建重组质粒pEGFP-GDNFcDNA

将回收的GDNFcDNA和载体质粒用BamHI和XhoI进行双酶切反应，双酶切产物经0.8%瓊脂糖凝胶电泳检切出DNA条带用胶回收试剂盒纯化后合并，加入T4 DNA连接酶16℃连接过夜

1.2.3转化感受态细菌、细菌的扩增及质粒提取

取上述连接后反应液10ul，加感受态细菌JM109 100ul冰上放置20min，然后420C热休克2min， 加1ml LB，37 0C震荡培养30min， 取100ul涂布到卡那霉素培养平皿上，370C培养过夜。然后挑起单个克隆接种到5ml LB+Kana培养液中37 0C震荡培养18小时提取质粒.质粒提取方法按质粒提取试剂盒操作手册中常规碱裂解法提取。质粒命名为pEGFP-GDNG（代号为C3M-GDNF）。

1.2.4质粒的鉴定及pEGFP-GDNF的测序。

将构建的重组质粒pEGFP-GDNF予以双酶切（BamHI / XhoI）后电泳鉴定及测序。

2 结果

2.1 GDNFcDNA PCR产物的扩增结果

用大鼠的GDNFcDNA中加入设计的引物进行扩增，对扩增产物进行琼脂糖电泳实验，纯化后获得的GDNF片段长度630bp，与预期片段长度相一致，无明显非特异性扩增带（图-1）。

2.2 重组质粒pEGFP-GDNFcDNA的双酶切鉴定结果

将pEGFP-GDNFcDNA用BamHI / XhoI双酶切，切出GDNAcDNA及pEGFP-C3进行电泳（图-2），pEGFP-GDNFcDNA经双酶切后分别切出GDNFcDNA及载体质粒，很据酶切电泳图谱，重组质粒pEGFP-GDNFcDNA总大小约6.0kb，及双酶切后切出630bp与5.4kb两条电泳带，与预期结果一致。

2.3 pEGFP-GDNFcDNA测序结果

将最终构建成功的pEGFP-GDNFcDNA送交测序，结果如图（图-3），与GeneBanK结果一致，测序正确。

3 讨论

神经营养因子（NTFs）在神经再生、突触形成以及神经损伤修复过程中起着重要作用，NTFs由神经元及神经元支配的靶器官或胶质细胞产生，可以在神经轴突中进行顺行、逆行性转运[4] Curtis R，Scherer SS，Somogyi R，Ip NY.Retrograde axonal transport of LIF is increased by peripheral nerve injury：correlation with increased LlF expression in distal nerve.[J].Neuron，1994，12（）：19l-204.，到达神经中枢，发挥其生物学效应。其中GDNF在促进神经元的生长、分化和损伤后的修复方面被认为是最有效的神经营养因子[5] Barbara F，Macie JF，Jurgen E，et al.CNS glial are targets for GDNF and neurturin.[J].Histochem Cell Biol，1998，110（2）：595-601.，不仅对中枢神经系统，而且对周围的运动、感觉和自主神经系统也有同样的作用[[[6] Choir DL，Lin Q，Chang YN，et al.Dopaminergic neurons protected from degeneration by glial cell linedderived neurotrophic factor gene therapy[J].Science，1997，275（5）：838-841.，同时在防止神经元的损伤，损伤后的修复再生等方面有其他生长因子无法比拟的作用[7] Hisashi K，Chihoko S，Wen RZ，et al.Induction of glialcell line-derived neurotrophic factor receptor proteins incerebral cortex and striatum after permanent middle cerebral artery occlusion in rat.[J].Brain Research，1999，834（5）：190-195]]。由于GDNF在脑内含量较少，单纯依赖生物提取无法大量获得。而且目前在研究GDNF生物学效应的实验中，给药方式绝大多数都是脊髓鞘内或者蛛网膜下腔局部注射治疗。局部注射GDNF有很多缺点：首先注射部位定位困难，一次给药后很快降解，多次给药使治疗复杂，增大了创伤和感染的机会，而且过量的GDNF注射会带来副作用[8] Georgievska B，Kirik D，Bjorklund A，et al. Aberrant sprouting and downregulation of tyrosine hydroxylase in lesioned nigrostriatal dopamine neurons induced by long-lasting overexpression of glial cell line derived neurotrophic factor in the striatum by lentiviral gene transfer.[J].Exp Neurol，2002，177（2）：461-474]，最后由于GDNF是大分子物质，难以通过血脑屏障，使得其很难到达脑内发挥其生物学作用。因此，学者们将目光集中到基因治疗上，及通过一定的载体将GDNA转入体内，使其在体内稳定表达，长期发挥其生物学效应。

基因治疗的步骤包括：目的基因的获得，表达载体的构建，靶细胞的选择，将目的基因导入靶细胞的方法，目的基因在宿主细胞的表达。本研究根据GeneBank报道的GDNF基因序列，自行设计引物，使GDNFcDNA大量扩增，琼脂糖电泳结果表明，扩增的DNA长630bp，与文献报道一致。接着对扩增产物及脂质体进行酶切，构建重组质粒pEGFP-GDNF cDNA。根据文献报道，GDNF的N末端氨基酸残基对其生物活性的维持作用不大[9]Eigenbrot C，Gerber N. X-ray structure of glial cell-derived neurotrophic 1.9 resolution and implications for receptor binding[J].Nat Struct Biol，1997，4：435-438.]]，因此目前绝大多数实验是将EGFP基因连接到GDNF基因的5‘端，两者之间以编码柔软肽段的核苷酸连接以保持EGFP与GDNF各自的活性，这样既保留了GDNF蛋白对神经的营养活性，又可以通过EGFP观察GDNF蛋白在体内的表达[10] Che ZY，He ZY，He C，et al.Human glial cell-derived neurotrophic factor：a [11]structure-function analysis[J].Biochem Biophys Res Commun，2000，268（3）：692-696..。本實验同样将质粒连接到GDNF基因的5‘端，为下一步观察将重组质粒转染到靶细胞后的生物学效应提供了依据。但通过该方法构建的重组质粒在动物体内是否可以发挥正常生物学活性，还需动物实验证实。目的基因与载体形成重组体的过程中需要特异性核酸内切酶，限制性内切酶酶切后产生的是两种不相同的粘性末端，提高了基因重组技术中T4 DNA连接酶连接反应的效率。及确保GDNFcDNA片段是正向、单倍插入到载体pEGFP-C3中。对重组质粒再次用限制性内切酶BamHI 、XhoI双酶切进行双酶切，根据电泳条带重组质粒大小6.0Kb，切出的扩增产物大小约630bp，pEGFP-C3大小为5400bp，两者之和为重组质粒的大小，证明通过双酶切连接后确实得到了需要的重组质粒。抽提质粒DNA成功的关键是把染色体DNA、蛋白质、RNA去除干净，获得纯度较高的质粒DNA。由图-2第3道电泳图谱可以看出有两条电泳亮带，其中分子量小的大约相当于3.5kb的条带可能就是未除去的蛋白质或RNA，也有可能是质粒酶切不完全导致连接产物中含有空质粒。针对这一问题，我们加强了对电泳胶带的回收纯化，并应用YT丰富的培养基，用多级培养的方法，在大肠杆菌的培养基内挑取一个单一菌落在接种到一个新的培养基，经培养一段时间后再次挑取单一菌落接种只新的培养基，如此反复多次，则可保证提取质粒DNA的参量和纯度，另外在抽提过程中要把握好变性和复性的时机，使试剂与染色体充分作用变性，又要使染色体DNA不至断裂与质粒DNA相混淆。

大腸杆菌表达系统是较为常用的一种。其优点是遗传背景比较清楚，表达水平较稳定，易操作，有许多菌株突变体和含强启动子的载体可供选择，并且成本低、蛋白表达量高、容易纯化等。在重组质粒的构建中，本实验是通过化学法将GDNF和质粒连接反应液转化JM109感受态，感受态是本实验室通过CaCl2法制备获得，将PCR阳性单菌落挑至新鲜的LB液体培养基中过夜培养，第二天将菌液送西安交通大学法医学司法鉴定中心代为测序，结果表明片段为630bp，与文献报道一致，且未发生突变。

本研究成功扩增大鼠GDNFcDNA基因，并成功构建重组质粒pEGFP-GDNFcDNA，经双酶切及测序证明与文献报道一致，未发生异常突变。GDNF因其具有强大的神经营养作用，而被越来越多的应用到帕金森、脑缺血、脊髓损伤、神经痛等的治疗和神经再生研究中，本课题成功扩增并构建重组质粒，对于GDNF的基因治疗及下一步利用合适的载体介导重组质粒在大鼠体内转染，观察GDNF基因治疗的可行性并进一步验证该重组质粒的活性奠定了基础。

参考文献

[1] Lin LFH，Doherty DH，Lile JD，et al.GDNF：a glial cell line-derived neurotrophic factor for midobrai dopaminergic neurons.[J].Science，1993，260（5111）：1130-1132

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[3]Annette Markus，Tushar D，Patel，William D.Snider. Neurotrophic factors and axonal growth[J].Curr Opin Neurobiol，2002，12（5）：523-53

[4]Curtis R，Scherer SS，Somogyi R，Ip NY.Retrograde axonal transport of LIF is increased by peripheral nerve injury：correlation with increased LlF expression in distal nerve.[J].Neuron，1994，12（）：19l-204.

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[8]Georgievska B，Kirik D，Bjorklund A，et al. Aberrant sprouting and downregulation of tyrosine hydroxylase in lesioned nigrostriatal dopamine neurons induced by long-lasting overexpression of glial cell line derived neurotrophic factor in the striatum by lentiviral gene transfer.[J].Exp Neurol，2002，177（2）：461-474

[9]Eigenbrot C，Gerber N. X-ray structure of glial cell-derived neurotrophic 1.9 ？ resolution and implications for receptor binding[J].Nat Struct Biol，1997，4：435-438.

[10]Che ZY，He ZY，He C，et al.Human glial cell-derived neurotrophic factor：a [11]structure-function analysis[J].Biochem Biophys Res Commun，2000，268（3）：692-696.