Folin睠iocalteu法测定昭通苹果总酚含量

袁晓春 李辅碧 陈屏昭

摘要

[目的] 采用FolinCiocalteu法测定苹果总酚含量，探索基层实验室快速准确测定苹果总酚的有效方法，为昭通苹果生产及加工工艺提供科学依据。[方法] 采用70%乙醇酸性溶液作溶剂，35 ℃下超声提取苹果总酚，以FolinCiocalteu试剂和120 g/L Na2CO3溶液处理，在765 nm处测其吸光度。 [结果] 以沒食子酸为标准，质量浓度在0～125.4 mg/L范围内与吸光度线性关系良好（r=0.999 1），据此测定昭通苹果试样的总酚含量范围为361.1～1 008.0 mg/kg，加标回收率试验结果为103.2%，RSD 1.4%。 [结论] 该方法操作简便，重复性好，结果准确可靠，适用于基层实验室。

关键词昭通苹果；FolinCiocalteu法；测定；总酚

中图分类号S609.9文献标识码A文章编号0517-6611（2015）21-292-03

近年来，广泛存在于蔬菜、水果、豆类、谷物类等植物中的植物多酚，因为其重要作用，而倍受人们关注。植物多酚在苹果、葡萄、荔枝、浆果等水果中的含量极高。苹果是多酚的主要来源，苹果多酚具有独特的生理功能活性，是一种有效的自由基清除剂，具有很好的开发应用前景[1]。

苹果中富含维生素、矿物质、黄酮类、酚类等活性物质，是一种很好的食材，无论西洋苹果还是中国苹果，都深受人们的喜爱。有研究表明，苹果是荷兰人饮食中第三大黄酮醇类物质的食物来源，仅居于茶和洋葱之下；在芬兰，则与洋葱并列第一。在美国水果酚类的22%来自于苹果，排列第一。一系列研究表明，吃苹果和预防许多慢性病是相关的，冠心病、慢性阻塞性肺病、脑中风均和食用苹果量相关。我国老百姓喜爱苹果，普遍认同吃苹果时连皮吃更有营养。研究证明，水果果皮中的多酚含量确实比果肉中的要多。苹果的基因型、培育条件、生长区都对苹果多酚的浓度和清除自由基能力起到不同的作用，果皮的作用更明显，这是因为致病的压力大多作用于果皮[2-4]。

我国苹果古称为“柰”，我国史书自汉以后历代皆有记载[4]。昭通苹果种植历史悠久，于1940年便被引入栽种[5]，发展至今，具有了早果、丰产、果面色泽鲜艳、风味香甜浓郁、肉质爽脆可口，成熟期较北方早30 d等特点。加之得天独厚的地理优势和区位优势，昭通由此赢得 “苹果之乡”的美誉[6]。近年来，虽然昭通苹果产量大增，但在苹果的品质提升和加工等方面还需提高和发展。研究昭通苹果多酚对提升昭通苹果品质和苹果生产具有现实意义。

考虑到基层实验室人力、物力有限的现状，拟定以乙醇为溶剂，利用超声提取技术，采用FolinCiocalteu法，常温下测定苹果多酚。此法所需设备仪器简单，试验操作简便快速。力求通过试验，探索出基层实验室简单、快速、准确测定苹果总酚的有效方法。

1材料与方法

1.1材料

1.1.1

试样。昭通本土出产的红富士苹果样品1、2、3、4、5号（1号、2号由陈屏昭提供， 3号、4号、5号从市场分批购进）。

1.1.2

主要试剂。

没食子酸标准品，中国食品药品检定研究院；无水乙醇（分析纯），成都市科龙化工试剂厂；盐酸（优级纯），西陇化工股份有限公司；FolinCiocalteu试剂（分析纯），上海荔达生物科技有限公司；无水碳酸钠（分析纯），天津化学试剂三厂；水，超纯水。

1.1.3

主要仪器。HR2843 Philips搅拌机，巴西制造；MS105DU电子天平，梅特勒-托利多公司；PHS828型酸度计，上海精密科学仪器有限公司；UC7100S超声波清洗器，美瑞泰克科技（天津）有限公司；TG16WS台式高速离心机，长沙湘仪离心机仪器有限公司；UV2550紫外可见分光光度计，日本岛津公司。

1.2方法

1.2.1

试剂的配制。没食子酸标准溶液（现配）：用电子天平称取0.020 90 g没食子酸标准品溶解于7.0 ml的无水乙醇中，并用水定容至100 ml，计算其浓度为209.0 mg/L。

120 g/L Na2CO3溶液：称取120 g无水Na2CO3，溶于水并定容至1 000 ml。70%乙醇酸性溶液[7]：量取700 ml 乙醇，加水稀释定容至1 000 ml，并滴加盐酸，调节溶液酸度至pH 4.30。

1.2.2

试验条件的选择。

1.2.2.1

选择试验波长。准确移取209.0 mg/L没食子酸标准溶液0.50 ml于25 ml容量瓶，先加6 ml左右水稀释，再依次加入1.00 ml FolinCiocalteu试剂和一定体积的120 g/L Na2CO3溶液，定容摇匀，25 ℃下反应一段时间，于不同波长处测其吸光度。

1.2.2.2

选择显色条件。综合文献资料[7-18]和基层实验室条件，通过试验选择测定苹果多酚的显色条件：准确移取209.0 mg/L没食子酸标准溶液0.50 ml于25 ml容量瓶，先加6 ml左右水稀释，再依次加入1.00 ml FolinCiocalteu试剂和不同体积的120 g/L Na2CO3溶液，定容摇匀。25 ℃下反应一段时间后，每间隔15 min，于“1.2.2.1”试验确定的波长处，分别测定其吸光度。依据试验结果，确定Na2CO3溶液用量及显色时间。

1.2.3

绘制标准曲线。准确移取不同体积的209.0 mg/L没食子酸标准溶液，按照“1.2.2”进行试验，绘制标准曲线。

1.2.4

测定苹果多酚总量。将苹果样品洗净后用不锈钢刀具切开，捡出果籽并记录苹果籽颜色，后将剩余部分（包括果核、果皮）切成5 mm以下的碎块，混匀后称取100 g放入搅拌瓶，加水100 ml后破碎60 s，制成匀浆[12]。准确称取该匀浆10 g，以70% 乙醇酸性溶液定容至100 ml，35 ℃下超声提取40 min，冷却，用干燥滤纸过滤；准确移取滤液1.00 ml，按照“1.2.2”进行试验，并依据标准曲线计算样品中苹果多酚含量。

1.2.5

方法评价。按“1.2.4”试验方法进行以下试验。①重复性试验：从同一批样品中随机抽取5个苹果，分别制成匀浆后测其吸光度，计算总酚及其相对标准偏差。②精密度试验：对同一苹果样品待测试液的吸光度平行测定5次，计算总酚及其相对标准偏差。③加标回收率试验：向已知苹果多酚含量的样品试液中，分别加入一定体积的 209.0 mg/L没食子酸标准溶液，测定其吸光度，并计算其总酚回收率及其相对标准偏差。

2 结果与分析

2.1 确定测试波长

准确移取209.0 mg/L没食子酸标准溶液0.50 ml于25 ml容量瓶，先加6 ml左右水稀释，再依次加入1.00 ml FolinCiocalteu试剂和8.00 ml 120 g/L Na2CO3溶液，定容摇匀，25 ℃下反应60 min，于700～800 nm波长范围内测其吸光度。

由表1表明，在765 nm处吸光度最大，确定765 nm为该试验的测定波长。

2.2反应条件的确定

2.2.1

确定Na2CO3用量。准确移取209.0 mg/L没食子酸标准溶液0.50 ml于25 ml容量瓶，先加6 ml左右水稀释，再依次加入1.00 ml FolinCiocalteu试剂和不同体积的 120 g/L Na2CO3溶液，定容摇匀，25 ℃下反应60 min，于765 nm波长处测其吸光度。

另取苹果试液在相同条件下进行测定，发现Na2CO3用量在4.00 ～ 8.00 ml范围内，试液出现少量白色沉淀；Na2CO3用量大于8.00 ml以后，白色沉淀较多（表2），这与文献资料的结果一致[13]。考虑到白色沉淀的生成将影响吸光度测定，少量白色沉淀量影响较小，因此确定120 g/L Na2CO3用量为8.00 ml，并且在测定苹果多酚时，先将显色试液进行离心处理，再测定吸光度。

2.2.2

确定显色时间。

准确移取209.0 mg/L没食子酸标准溶液0.50 ml于25 ml容量瓶，先加6 ml左右水稀释，再依次加入1.00 ml FolinCiocalteu试剂和8.00 ml 120 g/L Na2CO3溶液，定容摇匀，25 ℃下反应15 min后开始，于765 nm波长处测定其吸光度，每间隔15 min测定一次。表3表明，显色反应在60 min后的吸光度趋于稳定。

由此确定此次试验的反应条件：FolinCiocalteu试剂用量为1.00 ml，120 g/L Na2CO3 用量为8.00 ml，25 ℃下显色60 min。

2.3绘制标准曲线

准确移取209.0 mg/L没食子酸标准溶液0、0.10、0.20、0.30、0.40、0.50、0.60 ml于25 ml容量瓶，先加6 ml左右水稀释，再依次加入1.00 ml FolinCiocalteu试剂和8.00 ml 120 g/L Na2CO3溶液，定容摇匀， 25 ℃下反应60 min，于765 nm处测定其吸光度（表4）。

据此以吸光度对没食子酸标准溶液的质量浓度作图，总酚含量在0～125.4 mg/L范围内与吸光度呈良好的线性关系，线性计算公式y=0.005 4x+0.013 6，r=0.999 1。

2.4 方法评价

2.4.1

重复性试验。分别从1号、3号苹果样品中，随机抽取5个苹果，按照“1.2.4”的方法试验并计算。由表5可见，1号苹果总酚平均含量384.5 mg/kg，RSD 4.0%；3号苹果总酚平均含量968.1 mg/kg，RSD 3.6%。

2.4.2

精密度试验。对4号苹果试液平行5次测定吸光度并计算，得到5次测定总酚含量分别为792.1、788.6、802.5、806.0、809.5 mg/kg，平均

799.7 mg/kg，RSD 1.1%。

2.4.3

稳定性试验。选用3号苹果试液，在完成测定后的下列各时间段，再测定其吸光度并计算。试验得出，在10、20、30、40、50、60 min时，总酚含量依次为1 008.0、1 012.0、1 015.0、1 022.0、1 018.0、1 015.0 mg/kg，RSD 0.5%。

2.4.4

加标回收率试验。准确吸取4号苹果试液0.50 ml，分别加入0.15、0.20、0.25 ml 的209.0 mg/L没食子酸标准溶液，按照“1.2.4” 试验方法测定其吸光度并计算，结果见表6。

试验数据表明，该试验方法的重复性、稳定性、回收率较好。

2.5试样苹果多酚的测定

从1、2、3、4、5号样品中随机抽取2个[8]，按照“1.2.4”试验方法测定并计算，得出1号苹果样品中总酚含量分别为402.2、361.1 mg/kg，2号苹果样品总酚含量分别为466.0、452.3 mg/kg，3号苹果样品总酚含量分别为1 008.0、912.7 mg/kg，4号苹果样品总酚含量分别为792.1、808.0 mg/kg，5号苹果样品总酚含量分别为

6308、651.8 mg/kg。此次试验试样的苹果多酚含量范围361.1～1 008.0 mg/kg。

3 結论与讨论

采用70%乙醇酸性溶液作溶剂，35 ℃下超声提取苹果总酚，以FolinCiocalteu法测定苹果总酚的反应条件：FolinCiocalteu试剂用量1.00 ml ，120 g/L Na2CO3 用量8.00 ml，25 ℃下显色60 min。以没食子酸为标准，在0～125.4 mg/L范围内呈良好的线性关系（y=0.005 4x+0.013 6，r=0.999 1）。方法简单、快速、准确，适用于基层实验室测定苹果多酚。

样品1号和2号着色浅红，甜脆，采摘后低温保存约25 d；3号着色红黑，果肉有些许涩味，采摘后低温保存约30 d；4号和5号着色红色，甜脆，采摘后低温保存约3 d。试验结果表明，果面着色较深、果籽颜色较深、果子涩味较浓、采摘后保存时间较短的苹果，其总酚含量较高。样品的苹果总酚含量范围：361.1～1 008.0 mg/kg，差别较大；这与苹果品种、生长条件、采摘时间、成熟度、保存方法等因素有关。此试验结果与国内外文献资料相符[19-21]。

1号样品经过亚硫酸氢盐处理，2号样品为其对照品，1号样品的总酚含量稍低于2号样品。亚硫酸氢盐对云南昭通红富士苹果产量和品质的影响较大，能有效促进果实增产，改善果实外观品质，提升果实内在品质（如提高维生素C的含量等）[22-23]。但是维生素C的含量会随着苹果贮存时间的延长而降低。赵晓娟等的研究表明，在测定苹果醋饮料总酚时，添加维生素C后的吸光度比对照品的吸光度有较明显的增加[24]。因此，在测定苹果多酚时，不能忽视样品中存在的维生素C对测定的影响。维生素C含量高低对测定苹果多酚的影响程度还需进一步研究。

苹果果肉、果皮、叶子中酚类的类别和质量构成了苹果饮食的健康功效，深入了解苹果酚类动态变化有助于育种计划的制定[25]。测定苹果多酚并掌握其变化情况，对进一步提高苹果品质具有重要意义。

安徽农业科学2015年

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