昆仑雪菊对结肠癌细胞株体外抗肿瘤作用研究

帕尔哈提·买买提依明　令狐晨　朱青梅等

摘要 [目的]探讨昆仑雪菊中总黄酮粗提取物、纯化物及总多糖对人结肠癌细胞株（HCT116细胞、CACO2细胞）增殖的抑制作用。[方法]体外培养结肠癌细胞，采用不同浓度昆仑雪菊中总黄酮粗提取物、纯化物及总多糖对其进行干预，MTT法检测细胞生长抑制率，流式细胞仪测细胞凋亡率。[结果]MTT法检测昆仑雪菊中总黄酮粗提取物、纯化物及总多糖对结肠癌细胞株的抑制作用具有浓度和时间依赖性；流式细胞仪检测昆仑雪菊总黄酮纯化物能增强结肠癌细胞株的凋亡率，且剂量与凋亡率呈正相关。[结论]昆仑雪菊总黄酮纯化物抗肿瘤活性优于总黄酮粗提物及总多糖，且对结肠癌细胞株的增殖有明显抑制作用，其作用机制可能与增强细胞凋亡有关。

关键词 昆仑雪菊；结肠癌细胞；生长抑制；细胞凋亡；抗肿瘤

中图分类号 S567.21+9 文献标识码 A 文章编号 0517-6611（2015）20-146-03

Abstract [Objective]To investigate the anti-proliferative effect of the total flavonoids， the total polysaccharides from Coreopsis Ticntoria flowers of Kunlun mountain on the colorectal cancer cells. [Method] The colorectal cancer cells were cultured in vitro. The total flavonoids and the total polysaccharides of Coreopsis Ticntoria flowers interene the cells. The viability of cells was measured by MTT. The cell apoptosis was detected with flow cytometry. [Result] Different concentrations of the total flavonoids and the total polysaccharides were cytotoxic to cells in a time and dose dependent manner. The purified extracts of the total flavonoids could enhance apoptisis rate of the cells， and dose and apoptosia rate were positively correlated. [Conclusion] The anti-proliferative effect of purified extracts of the total flavonoids on the cells was stronger than the crude extract of the total flavonoids and the total polysaccharides. The mechanism may be related to the inhibition apoptisis rate of the cells.

Key words Coreopsis Ticntoria flowers of Kunlun mountain； Colorectal cancer cells； anti-proliferation； Apoptisis rate of the cells；Antitumor

昆仑雪菊为菊科金鸡菊属（Coreopsis），是一年生草本植物的干燥头状花序，具有独特功效的稀有高寒植物[1]。常饮雪菊茶，有神奇的降压、降脂作用，且具有很好的清肝明目、益肝补阴、美容养颜、润肠通便之特性，对用眼过度造成的视觉疲劳与饮酒造成的肝脏伤害等症状有一定的缓解作用[2]。国内关于雪菊的体外抗肿瘤并未报道，国外的报道仅限于雪菊的单体对小鼠皮肤肿瘤抑制作用[3]。20世纪以来癌症发病一直呈上升的趋势，肿瘤现已成为严重威胁人类生命健康且较广泛的疾病，肿瘤的防治也成为世界范围内广泛重视的课题，不少国家已注意到使用传统医学方法进行防治，特别是对具有数千年历史的中医中药非常关注[4]。因此该研究探讨了昆仑雪菊总黄酮粗提取物、纯化物及对结肠癌细胞株增殖的抑制作用以及对细胞凋亡的影响。

1 材料与方法

1.1 材料

1.1.1

仪器和试剂。CO2培养箱（美国Thermo公司）；Benchmark PLUS型全波长酶标仪（美国BIORAD公司）；流式细胞仪（美国BECKMAN公司）；倒置荧光三目显微镜（美国CoolSNAP）；ZHJH1214C型超净工作台（中国上海智城有限公司）；TP114型电子天平（美国丹佛公司）；Br4i型低温离心机（美国Jouan公司）；胚胎牛血清（杭州四季青生物工程材料有限公司，批号141012）；二甲基亚砜（美国MP Biomedicals公司，批号M5178 ）；培养基（美国HyClone公司，批号AZG190856）；噻唑蓝MTT（美国sigma公司，批号M5655）；凋亡检测试剂盒（美国BD公司，批号3337788）；胰酶（美国Gibco公司，批号25200）。

1.1.2

肿瘤细胞。人结肠癌细胞（HCT116细胞、CACO2细胞）由新疆第一附属医院基础医学研究所阿尔孜古丽·吐尔逊老师惠赠。

1.1.3

藥材。昆仑雪菊为菊科金鸡菊属（Coreopsis）植物，于2013年6～9月在新疆和田地区昆仑山采集，经新疆医科大学药学院天然药物化学/生药学教研室帕丽达·阿布力孜教授鉴定为菊科金鸡菊品种。

1.1.3.1

昆仑雪菊总黄酮提取物。雪菊于60 ℃干燥1 h，研磨，过三号筛，备用。称取雪菊适量，按1∶20投料比加50%乙醇40 ml，浸泡1 h，利用超声微波协同萃取仪萃取30 min，过滤，滤液减压浓缩得其浸膏，测定总黄酮含量为22.56%。

1.1.3.2

总黄酮纯化物。由雪菊总黄酮粗提物经聚酰胺纯化工艺获得，总黄酮含量为68.04%。

1.1.3.3

昆仑雪菊总多糖。雪菊于60 ℃干燥1 h，研磨，过三号筛，备用。称取雪菊适量，1∶20投料比，加40 ml蒸馏水，浸泡1 h，利用超声微波协同萃取仪，超声30 min，过滤，滤液减压浓缩得其浸膏，测定总多糖含量为24.74%。

1.2 方法

1.2.1

细胞培养。将人结肠癌细胞接种于含10%灭活胚胎血清的高糖DMEM培养液中，在37 ℃饱和湿度及5% CO2的细胞培养箱中培养，细胞长至培养瓶的80%进行传代培养，取对数生长期细胞进行试验。

1.2.2

制备供试液。精密称定雪菊总黄酮粗提取物、纯化物及总多糖浸膏各0.1 g，用二甲基亚砜（DMSO）溶解，并定容于10 ml容量瓶中，配制成质量浓度为5 g/L的3种供试液，4 ℃冰箱保存，临用前用培养液稀释分别配制成不同浓度的3种供试液（DMSO体积分数低于0.1%）。

1.2.3

MTT法检测样品对结肠癌细胞增殖的抑制作用。将处于对数生长期HCT116细胞、CACO2细胞分别以3×104个/ml接种于96孔培养板中，培养于含10%胎牛血清的DMEM高糖培养液中，在37 ℃饱和湿度及5%CO2的细胞培养箱中培养24 h，24 h后，观察其贴壁情况，将每孔的培养液取出后，加入系列浓度的待测样品溶液。经过初步的筛选后确定试验组设6个药物浓度组，每组药物的最终浓度为50、100、200、400、600 μg/ml，对照组加入同样浓度的DMSO，阳性对照组则为浓度为20 μg/ml的顺铂，每组4个孔，置37 ℃、5%CO2培养箱中培养，分别培养48、72、96 h，培养结束前4 h，每孔加MTT 20 μl继续培养4 h后，弃去上清液，然后每孔加DMSO 150 μl，振荡充分溶解结晶物后，用Model550多孔自动酶标仪比色（波长490 nm），测吸光度值，并按公式计算细胞生长抑制率，生长抑制率=（1-试验组平均OD值/对照组平均OD值）×100%[5]。

1.2.4

流式细胞仪检测细胞凋亡。取对数期HCT116细胞、CACO2细胞，以每孔3×105个细胞的密度接种于6孔培养板，培养24 h后，观察其贴壁状况，状态良好时，分别加入100、200、400 μg/ml不同浓度的雪菊总黄酮纯化物，并设立细胞对照组（不加药物），再置于37 ℃、5%CO2的培养箱中分别培养48 h后终止培养，把各孔的细胞培养液分别吸出到15 ml离心管中内，PBS洗涤贴壁细胞，用胰酶将细胞消化收集结肠癌细胞，充分消化成单细胞悬浮液，细胞消化完成后，收集并放入离心管中，1 000 r/min离心5 min，弃去上清液，收集细胞，加入1 ml PBS轻轻重悬细胞并计数。取含有1×106个细胞悬浮液，1 000 r/min离心5 min，弃上清液，加入100 μl binding buffer轻轻重悬细胞，接着分别加入5 μl Annexin VFITC和PI，轻轻混匀。室温避光孵育15 min，再加入400 μl的binding buffer，隨即用流式细胞仪检测细胞凋亡率。

1.2.5

统计方法。试验数据均采用SPSS 17.0统计软件进行分析，数据均以x±s表示，多组间比较采用单因素方差分析，组间两两比较采用LSD检验，P<0.05为差异有统计学意义。

2 结果与分析

2.1 对结肠癌HCT116细胞增长的抑制作用

用浓度分别为50、100、200、400、600 μg/ml的雪菊不同提取物的溶液作用于HCT116细胞，72 h后，观察不同浓度的样品对HCT116细胞增殖的影响。由表1可知，雪菊总黄酮粗提取物、纯化物及总多糖对结肠癌HCT116细胞均有抑制作用，其IC50分别为421.68、69.21、815.68 μg/ml，随着浓度的增加，细胞增殖的抑制率增大，雪菊的不同提取物对结肠癌HCT116细胞生长抑制影响呈剂量依赖性。通过各提取物的IC50比较，雪菊总黄酮的纯化物对结肠癌HCT116细胞抑制作用强于总黄酮的粗提取物及总多糖。

从雪菊不同提取物浓度为200 μg/ml时不同提取物对HCT116细胞作用随时间增长的关系（图1）可看出，样品浓度固定时，随着样品作用时间的增加，雪菊总黄酮粗提物、纯化物及总多糖对HCT116细胞增殖的抑制作用增强，呈现时间依赖性。

2.2 对结肠癌CACO2细胞增长的抑制作用

用浓度分别为50、100、200、400、600 μg/ml的雪菊不同提取物的溶液作用于CACO2细胞，72 h后，观察不同浓度的样品对CACO2细胞增殖的影响。由表2可知，雪菊总黄酮粗提取物、纯化物及总多糖对结肠癌CACO2细胞均有抑制作用，其IC50分别为227.25、155.82、505.30 μg/ml，随着浓度的增加，细胞增殖的抑制率增大，雪菊的不同提取物对结肠癌CACO2细胞生长抑制影响呈剂量依赖性。通过各提取物的IC50比较，雪菊总黄酮的纯化物对结肠癌CACO2细胞抑制作用强于总黄酮的粗提取物及总多糖。

由雪菊不同提取物浓度为200 μg/ml时不同提取物对CACO2细胞作用随时间增长的关系（图2）可见，样品浓度固定时，随着样品作用时间的增加，雪菊总黄酮粗提物、纯化物及总多糖对CACO2细胞增殖的抑制作用增强，呈现时间依赖性。

2.3 流式细胞仪检测雪菊总黄酮纯化物对细胞凋亡率的影响

流式细胞仪Annexin V-PI双标法进行凋亡率的测定，结果表明（表3），100、200、400 μg/ml的雪菊总黄酮纯化物作用HCT116、CACO2细胞72 h后，随样品浓度加大，活细胞比例逐渐减少，细胞凋亡发生率明显增高。

3 结论与讨论

结肠癌是世界死因顺位中列第3位的肿瘤，尽管结肠癌的治疗手段有很大进展，但多年来晚期结肠癌的5年生存率并无多大改观。因此，结肠癌预防的意义愈显重要。由于主流的治疗癌症的方法有很大的缺陷，世界科学家开始把抗肿瘤药物研究的目光转移到天然产物上，从不同的中草药中提取抗肿瘤活性强的成分。总黄酮具有抗菌抗病毒活性、抗炎、抗肿瘤活性等。

MTT法是一种检测细胞功能的方法。细胞在活化增殖的过程中，线粒体的能量代谢能够把MTT法代谢为蓝紫色的甲臢，甲臢沉积于细胞内或细胞周围，通过二甲基亚砜溶解甲臢，用酶标仪检测其吸光度值。灵敏度高、简单，最常用于体外抗肿瘤药物筛选的方法。该研究采用MTT法对雪菊总黄酮粗提取物、总黄酮纯化物及总多糖进行体外对结肠癌细胞株抑制作用的研究，結果表明，雪菊总黄酮粗提物、总黄酮纯化物及总多糖对结肠癌细胞株有抑制作用，其中雪菊总黄酮纯化物抑制作用最强，从而进行雪菊总黄酮纯化物诱导细胞凋亡试验，采用流式细胞仪Annexin VPI双标法进行凋亡率的测定，结果表明随样品浓度加大，活细胞比例逐渐减少，细胞凋亡发生率明显增高。综上所述，昆仑雪菊总黄酮纯化物对结肠癌细胞株有很好的抑制作用，其机制可能与其诱导细胞有关。

参考文献

[1] 张彦丽，王艳，李新霞，等.高效液相色谱法测定昆仑雪菊中绿原酸和黄芩苷的含量[J].中国实验方剂学杂志，2012，18（4）：107-109.

[2] 木合布力·阿布力孜，张燕，景兆均，等.新疆昆仑雪菊化学成分的初步定性研究[J].新疆医科大学学报，2010，33（6）：628-630.

[3] YASUKAWA K，AKIHISA T，KASAHARA Y，et al.Inhibitory effect of heliantriol C：A component of edible Chrysanthemum，on tumor promotion by 12Otetradecanoylphorbol13acetate in twostage carcinogenesis in mouse skin[J].Phytomedicine，1998，5（3）：215-217.

[4] 杜崇民，刘春宇.黄酮类化合物抗肿瘤研究进展[J].中国野生植物资源，2007，26（3）：3-5.

[5] 王天山，陆跃鸣，马国祥，等.鼓槌石斛中化学成分对K562肿瘤细胞株生长抑制作用体外实验[J].天然产物研究与开发，1997，9（2）：1-3.