金匮肾气丸对肾阳虚大鼠睾丸转化生长因子—β1和细胞色素P—19表达的影响

张晓红等

摘要：目的 观察金匮肾气丸对肾阳虚及转化生长因子-β1（TGF-β1）受体阻滞后大鼠转化TGF-β1、细胞色素P-19（CYP19）、性激素水平和精子质量的影响，并探讨其治疗男性不育的作用机制。方法 将40只成年雄性SD大鼠随机分为正常组、模型组、阻滞剂组、金匮组，每组10只。除正常组外，腺嘌呤混悬液灌胃制备肾阳虚不育模型。正常组给予生理盐水灌胃，阻滞剂组注入大鼠睾丸间质TGF-β1受体阻滞剂，金匮组给予金匮肾气丸水煎剂灌胃。经尾静脉采血并摘取睾丸，采用免疫组化法、放射免疫法和电镜观察，检测睾丸TGF-β1和CYP19的表达、性激素水平、精子密度和活率及睾丸形态学改变。结果 与正常组比较，模型组TGF-β1表达水平升高、CYP19表达水平降低（P<0.05）；与模型组比较，金匮组和阻滞剂组TGF-β1表达水平降低、CYP19表达水平升高（P<0.05）。与正常组比较，模型组大鼠精子数量较少且形态异常（P<0.05）；与模型组比较，金匮组和阻滞剂组睾酮（T）、雌二醇（E2）、精子密度和活率升高（P<0.05）；金匮组和阻滞剂组各项指标比较差异无统计学意义（P>0.05）。结论 金匮肾气丸可改善肾阳虚模型大鼠精子质量和性激素水平，其机制可能是通过抑制睾丸TGF-β1受体表达、促进CYP19表达进而影响精子发育与增殖。

关键词：金匮肾气丸；精子；细胞色素P-19；转化生长因子-β1；大鼠

DOI：10.3969/j.issn.1005-5304.2015.09.020

中图分类号：R285.5 文献标识码：A 文章编号：1005-5304（2015）09-0072-04

Effects of Jingui Shenqi Pills on Expressions of Testicular TGF-β1 and CYP19 in Kidney-yang-deficiency Rats ZHANG Xiao-hong1， DONG Hai-jun2， WU Lei-tao2， ZHAO Jiao2， CHEN Yan-qiu2， YANG Qian-qian2， MA Jing2 （1.The Second People's Hospital of Jiuquan City， Jiuquan 735000， China；2.Xijing Hospital， Forth Military Medical University of PLA， Xian 710032， China）

Abstract：Objective To observe the effects of Jingui Shenqi Pills on the expressions of TGF-β1， CYP19， sex hormone level and sperm quality；To discuss its mechanism for the treatment of male sterility. Methods Forty adult male SD rats were randomly divided into normal group， model group， retardant group and Jingui Shenqi Pills group， 10 rats in each group. Except for the normal group， adenine was used to induce healthy rats to kidney yang deficiency and sterility model rats. Normal group was given normal saline for gavage；retardant group was injected with testicular mesenchyme TGF-β1；Jingui Shenqi Pills group was given Jingui Shenqi Decoction for gavage. Blood was taken through caudal vein. Immunohistochemical， radioimmunoassay and electron microscopy observation were used to detect the expressions of TGF-β1， CYP19， sex hormone level， sperm density and motility rate and testicular morphological changes. Results Compared with normal group， the expression of TGF-β1 in the model group increased and CYP19 decreased （P<0.05）. Compared with model group， the expression of TGF-β1 decreased and the expression of CYP19 increased （P<0.05）. Compared with normal group， the number of sperm quantity was small and paramorphia in model group （P<0.05）. Compared with model group， T， E2， sperm density and motility rate increased significantly in Jingui Shenqi Pills group and retardant group

基金項目：国家自然科学基金面上项目（30873206）；陕西省中医药管理局重点课题（13-JC049）

通讯作者：马静，E-mail：jingma@fmmu.edu.cn

（P<0.05）. There was no statistical significance among indexes in retardant group and Jingui Shenqi Pills group. Conclusion Jingui Shenqi Pills can improve sperm quality and sex hormone level of model rats with kidney-yang-deficiency， which mechanism is probably realized by inhibiting the expression of TGF-β1R and promoting the expression of CYP19 in testis to effect development and proliferation of sperm.

Key words：Jingui Shenqi Pills；sperm；CYP19；TGF-β1；rats

近年来，男性不育的发病率呈明显上升趋势，并已成为影响人类发展和健康的全球性的医学和社会问题。寻找更有效的药物和方法进行治疗，已成为生殖医学领域里的热点问题。现代研究表明，金匮肾气丸可通过调节下丘脑-垂体-性腺轴的功能，治疗男性少精、弱精[1-3]。前期研究显示，睾丸抑制转化生长因子-β1（TGF-β1）和细胞色素P-19（CYP19）的表达与精子发生有密切关系[4-5]，因此，本研究选用金匮肾气丸干预雄性肾阳虚不育大鼠模型，观察抑制TGF-β1受体（TGF-β1R）后，大鼠睾丸CYP19和TGF-β1的表达与精子数量和质量的关系，以期进一步探讨金匮肾气丸治疗男性不育的作用机制。

1 实验材料

1.1 动物

选取5月龄雄性SD大鼠40只，SPF级，体质量（260±10）g，第四军医大学实验动物中心，合格证号SCXK（军）2013-007。普通饲料，定时定量喂食，自由饮水，光照12 h、黑夜12 h交替喂养。

1.2 药物及制备

金匮肾气丸组方按《金匮要略》记载（干地黄24 g，山药12 g，山萸肉12 g，泽泻9 g，牡丹皮9 g，肉桂3 g，附子3 g），饮片均由第四军医大学西京医院药剂科中药房提供，将药材煎煮浓缩至含原药材1.35 g/mL， 4 ℃冰箱保存备用；SB431542准备：取1 mg SB431542，溶于2.6 μmol DMSO中。将含有SB431542的DMSO用1000 μmo1 PBS液稀释。

1.3 主要试剂与仪器

TGF-β1R阻滞剂SB431542、兔抗大鼠CYP19单克隆抗体、兔抗大鼠TGF-β1多克隆抗体及台盼兰染色剂，美国Santa公司；羊抗兔试剂盒，武汉博士德生物技术公司；腺嘌呤，美国Sigma公司；性激素放射免疫分析试剂盒，北京中杉生物技术公司。体视解剖镜（Nikon，SMZ1000），全自动精子分析仪SQAV（上海圣荷西医疗用品有限公司）。

2 实验方法

2.1 造模、分组与给药

SD大鼠适应性喂养3 d后，随机分为正常组、模型组、金匮组、阻滞剂组，每组10只。参考文献[6]方法，将腺嘌呤制成2 mL蒸馏水混悬液，造模大鼠连续灌胃150 mg/（kg·d），正常组灌服等量生理盐水，给药体积2 mL/d，连续30 d。各组大鼠均普通饲料喂养，自由饮食。成模后，金匮组给予大鼠金匮肾气丸水煎剂13.5 g/（kg·d）灌胃，连续30 d[4]。尾部静脉采血，脱颈处死，立即摘取睾丸组织并置于Bouin氏液中固定24 h，经70%、80%、90%、95%及100%梯度酒精逐级脱水后，进行石蜡包埋、切片以备相应检测。阻滞剂组按试剂说明书给予大鼠睾丸间质内注射TGF-β1R阻滞剂SB431542，50 μmol/只。其他组灌服等量生理盐水，连续30 d。

2.2 一般观察

定期测量各组大鼠体质量。

2.3 血清性激素水平測定

将采集的血液离心，取血清，参照试剂盒说明书，检测血清睾酮（T）、雌二醇（E2）、促卵泡素（FSH）和黄体生成素（LH）的水平。

2.4 精子密度和活率测定

采集精液，37 ℃水浴中孵育10 min，充分液化，置于全自动精子分析仪进行精子密度和活率测定。

2.5 细胞色素P-19、转化生长因子-β1的表达测定

采用免疫组化染色，将睾丸组织切片经二甲苯脱蜡3次，每次10 min；置于100%、95%、90%、80%、70%梯度酒精各10 min；抗原修复20 min；PBS液洗5 min×3次，甲醇-H2O2室温孵育30 min，封闭内源性过氧化物酶；PBS液洗5 min×3次，血清封闭，分别滴加1∶400兔抗大鼠TGF-β1及兔抗大鼠CYP19，4 ℃冰箱过夜，PBS液洗5 min×5次，滴加羊抗兔二抗于37 ℃恒温箱孵育30 min，PBS液洗5 min×3次，滴加SABC，37 ℃恒温箱孵育30 min；PBS液洗5 min×5次，DAB显色；PBS液终止显色，苏木精胞核复染、封片，光镜下检测TGF-β1及CYP19的表达。

2.6 睾丸超微结构观察

将睾丸组织切成2 mm×2 mm的小条，经初固定、后固定（pH 7.3～7.4），梯度酒精逐级脱水、Epon812包埋、固化、超薄切片机切片50～60 nm，3%醋酸铀-枸橼酸铅双染色，透射电镜观察睾丸超微结构。

3 统计学方法

采用SPSS17.0统计软件进行分析。实验数据以—x±s表示，组间比较采用方差齐性检验及方差分析，TGF-β1及CYP19表达均采用Kaplan-Meier法。P<0.05表示差异有统计学意义。