脾气虚证大鼠脑肠肽动态变化及四君子汤干预效应研究

田茸等

摘要：目的 探讨四君子汤对脾气虚证的动态干预效应及作用机制。方法 实验大鼠随机分为正常组、模型组、四君子汤组。除正常组外均以苦寒破气、游泳力竭双因素法复制脾气虚证模型，造模同时四君子汤组给予四君子汤20 g/（kg·d）干预，采用ELISA和放射免疫法检测不同时间点（14、21、28 d）模型大鼠小肠组织及血清中胃泌素（GAS）、胃动素（MTL）、生长抑素（SS）、血管活性肠肽（VIP）的活性，以及四君子汤的干预效应。结果 与正常组比较，模型组大鼠血清和小肠组织中GAS和MTL降低、SS和VIP升高（P<0.05，P<0.01）；与模型组比较，四君子汤组大鼠血清和小肠组织中GAS和MTL升高、SS和VIP降低（P<0.05，P<0.01）。结论 脑肠肽在脾气虚证大鼠小肠组织和血清中呈现动态时相性一致的变化，四君子汤可能通过调节大鼠脑肠肽的活性从而发挥其治疗脾气虚证的作用。

关键词：脾气虚证；四君子汤；胃泌素；胃动素；生长抑素；血管活性肠肽；大鼠

DOI：10.3969/j.issn.1005-5304.2015.09.019

中图分类号：R285.5 文献标识码：A 文章编号：1005-5304（2015）09-0068-04

Study On Dynamic Changes of Ghrelin of Spleen-qi-deficiency Rats and Intervention Effects of Sijunzi Decoction TIAN Rong1， GONG Zi-han2， YANG Xiao-yi2， ZHU Li-ming2， DUAN Yong-qiang2， CHENG Ying-xia2， DU Juan2， LI Lan-zhen2， WANG Yan2 （1.Chengdu University of Traditional Chinese Medicine， Chengdu 611137， China；2.Gansu University of Chinese Medicine， Lanzhou 730020， China）

Abstract：Objective To observe the dynamic changes of ghrelin of spleen-qi-deficiency rats and the intervention effects of Sijunzi Decoction. Methods Experimental rats were randomly divided into normal control group， model group and Sijunzi Decoction group. Except for normal control group， spleen-qi-deficiency model was copied through the two-factor methods of breaking qi by bitter cold and swimming exhausted. Meanwhile， Sijunzi Decoction group was given 20 g/（kg·d） Sijunzi Decoction intervention. The activities of GAS， MTL， SS and VIP at different time points （14， 21， 28 d） in intestine and serum were detected by ELISA and RIA. At the same time the intervention effect of Sijunzi Decoction was studied. Results Compared with normal control group， GAS and MTL in intestine and serum of model rats decreased， while SS and VIP increased （P<0.05， P<0.01）. Compared with model group， GAS and MTL in intestine and serum of rats in the Sijunzi Decoction group increased， while SS and VIP decreased （P<0.05， P<0.01）. Conclusion Ghrelin in intestine and serum of spleen-qi-deficiency rats shows dynamic coincidental changes. Sijunzi Decoction can treat spleen qi deficiency by regulating the activities of rat ghrelin.

Key words：spleen qi deficiency；Sijunzi Decoction；gastrin；motilin；somatostatin；vasoactive intestinal peptide；rats

脾氣虚证证候有食少、纳呆、食欲减退、泄泻或便秘等消化系统表现，以及神疲、精神不振、甚至记忆力减退等中枢神经系统表现，并且两方面临床症状会先后出现或同时出现。这符合现代医学所阐述的

基金项目：国家自然科学基金（81160420）；甘肃省自然科学研究基金计划（1010RJZA148）；甘肃省教育厅项目（1006-05）

“脑肠轴”理论，即脑肠轴为连接中枢神经系统与胃肠道的神经内分泌双向通路，一方面各种社会应激、情绪变化等作用于高级中枢神经，通过肠神经系统影响胃肠激素的分泌，从而调控胃肠感觉和运动；另一方面，胃肠道本身接收的各种刺激亦作用于肠神经系统，迷走神经反作用于中枢，产生相应反应。因此，脑肠轴实际上是一种脑肠互动[1]。本研究通过分阶段动态检测脾气虚证大鼠血清和小肠组织中脑肠肽的活性，旨在发现脾气虚证大鼠脑肠肽的动态表达是否有一定时相性，以及脑肠肽在不同组织中的表达是否具有一定的规律性，并在此基础上探讨论四君子汤对脾气虚证的动态干预效应及作用机制。

1 材料与方法

1.1 动物与分组

雄性SPF级Wistar大鼠94只，6周龄，体质量（170±20）g，甘肃中医药大学医学实验中心，合格证号SCXK（甘）2011-0001。大鼠适应性饲养3 d后，采用随机数字表法分为正常组、模型14 d组、模型21 d组、模型28 d组、四君子汤14 d组、四君子汤21 d组、四君子汤28 d组，分笼饲养。

1.2 药物

造模中药：大黄、枳实、厚朴（4∶2∶3）；四君子汤：人参、白术、茯苓、炙甘草（3∶3∶3∶2）。饮片购自兰州复兴厚中药材有限责任公司，甘肃中医药大学附属医院制剂室按中药常规煎法进行煎煮，滤液浓缩至折合原药材质量浓度2 g/mL备用。

1.3 主要试剂与仪器

胃泌素（GAS）、胃动素（MOT）、生长抑素（SS）及血管活性肠肽（VIP）ELISA试剂盒，上海源叶生物科技有限公司，批号20130601A。BL2420F生物机能实验系统，成都泰电子有限公司；Benchmark Plus酶联免疫检测仪，美国BIO-RAD公司。

1.4 造模

以苦寒破气、游泳力竭双因素法复制脾气虚证模型[2]，造模大鼠给予造模中药药液7.5 g/（kg·d）灌胃，并每日负重游泳，以力竭为度。脾气虚证模型复制成功评估标准依据《中药新药临床研究指导原则》[3]拟定：①蜷缩扎堆1分；②眯眼弓背1分；③食量减少1分；④体质量减轻1分；⑤便形质软1分；⑥便形溏稀2分；⑦肛温下降2分；⑧游泳耐力下降1分。结合评估标准及大鼠体重增长幅度、进食量、游泳力竭时间、胃残留率、小肠推进率等定量指标评判大鼠脾气虚证模型。具有大便稀溏、食欲下降2项症状，且总积分>5分，则认为脾虚模型造模成功。

1.5 分组及给药

四君子汤组大鼠在造模7 d后，继续造模的同时，给予四君子汤20 g/（kg·d）灌胃进行干预，灌胃体积为1 mL/100 g，连续3周（其中四君子汤用药量以临床等效剂量为标准，实验等效剂量按人与动物系数折算[2]，相当于60 kg成人每日临床用量的10倍）。正常组、模型组给予等体积蒸馏水，连续28 d。

1.6 检测指标

1.6.1 一般情况 每日观察各组大鼠毛发颜色、日常活动状况、大便性状，并观察记录大鼠体质量、进饲料量、游泳力竭时间。

1.6.2 胃残留率和小肠推进率测定 于实验14、21、28 d末，分别在大鼠取材前给予半固体米糊10 mL/kg灌胃处理，30 min后20%乌拉坦10 mL/kg腹腔注射麻醉，开腹，结扎胃贲门和幽门，取胃，用滤纸吸干后称全重，然后沿胃大弯剪开胃体，洗去胃内容物后擦干，称净重。胃全重与胃净重之差即为胃内残留物质量，以胃内残留物与所灌半固体米糊质量的百分比为胃内残留率。即胃残留率（%）=（胃全重-胃净重）÷半固体米糊重×100%。

同时迅速取出小肠，轻轻剥离后直铺于白纸上，测量幽门至回盲肠部全长及幽门至黑色半固体糊前沿距离。以幽门至黑色半固体糊前沿距离与幽门至回盲部全长百分比为小肠推进率。小肠推进率（%）=半固体糊推进距离÷小肠全长×100%。

1.6.3 离体肠管收缩功能测定 于实验28 d末，采用BL-2420F生物机能实验系统（采样率100 Hz）测定离体肠管收缩功能。取模型28 d组1只大鼠十二指肠，截取2段2 cm环形肌条；取正常组1只大鼠十二指肠，截取1段2 cm环形肌条。将3段肌条竖直悬挂于3个充满Kreb液的浴槽中（持续供应95%O2和5%CO2混合气体，37 ℃，pH 7.14），上端接肌张力换能器，下端固定在金属钩上，给予初始张力2 g，平衡1 h后开始在Kreb液中滴加四君子汤浓缩液，记录十二指肠肌条张力的变化。

1.6.4 小肠组织和血清胃泌素、胃动素、生长抑素及血管活性相关肠肽测定 于实验14、21、28 d末，分批处死大鼠，取十二指肠和血清，严格按照试剂盒说明书操作，ELISA测定大鼠小肠GAS、MTL、SS、VIP及血清SS、VIP，放射免疫法测定大鼠血清中GAS、MTL。

1.7 统计学方法

采用SPSS17.0统计软件进行分析。实验数据以—x±s表示，首先进行正态性、方差齐性检验。满足正态性者，不同组间比较采用方差分析。P<0.05表示差异有统计学意义。

2 结果

2.1 一般情况

正常组大鼠饮食、活动、大便形性状及毛发等均无异常，体质量稳定增长。模型组大鼠从14 d开始逐渐出现活动减少，毛发枯槁，逐渐出现眯眼弓背，喜扎堆，体质量下降，进食量减少，大便稀软；造模21 d后部分大鼠出现大便稀溏，少数出现水样便或肛门脱垂；造模28 d多数大鼠便质清稀，少数出现便秘。各四君子汤组大鼠的一般情况均较模型组有所改善，并随治疗时间的延长，进食量增加、活动增多，眯眼弓背和扎堆现象减少，大便性状接近正常。

2.2 四君子汤对大鼠体质量、进食量、游泳力竭时间、胃残留率、小肠推进率的影响

脾虚证模型大鼠随造模时间的延长，体质量增长幅度减缓，进食量下降，游泳力竭时间缩短，胃残留相对增多，小肠推进相对增强。说明大黄枳实厚朴药液灌胃结合游泳力竭成功复制了脾虚证模型，模拟了脾虚证患者的神疲乏力、少氣懒言、倦卧多寐、胃纳不香、纳食减少、停食积食、大便稀溏等症状。经过四君子汤治疗后，体质量增长幅度有所增加，进食量有所增多，游泳力竭时间有所增加，以及胃残留相对减少，小肠推进趋于正常。说明四君子汤能从整体上改善脾虚证大鼠的一般情况，对脾虚证相应症状都有很好的治疗效果。结果见表1、表2。

2.3 四君子汤对脾虚证模型大鼠离体肠管收缩功能的影响

经四君子汤干预后，脾虚证模型大鼠离体肠管的收缩从之前的不规律、幅度小、力度轻，到之后呈现出有规律收缩，并且收缩幅度增加，收缩力度增强，说明四君子汤具有改善肠道收缩的作用。

2.4 四君子汤对大鼠血清和小肠胃泌素、胃动素、生长抑素及血管活性肠肽的影响

与正常组比较，模型组大鼠小肠和血清中GAS和MTL明显降低、SS和VIP明显升高（P<0.05，P<0.01）；与模型组比较，四君子汤组小肠组织和血清中GAS和MTL明显升高、SS和VIP明显降低（P<0.05， P<0.01）。结果见表3、表4。

3 讨论

脑为奇恒之府，位置最上，为元神所居之地。小肠泌别清浊，大肠传化糟粕。浊气出，精汁藏，则脏腑得养，气机调畅，神乃正常。故有学者提出“脑肠相通”假说[4]。现代医学则认为，机体通过脑-肠轴之间的神经内分泌网络的双向环路进行胃肠功能的调节，即脑肠互动[5]，是由神经系统与胃肠道3个层次的交互调控来实现的。

脑肠肽是双重分布在神经中枢和胃肠道的一类神经递质，是脑肠轴的重要组成部分，是认知和情感中枢与神经内分泌、内分泌和免疫系统相联系的双向交通通路的分子基础。其在调节内脏感觉、分泌、运动中起着重要作用。常见脑肠肽有GAS、MTL、VIP、SS等。目前认为，促使胃肠平滑肌兴奋脑肠肽主要有MTL、P物质等，使其抑制的脑肠肽主要有SS、VIP等。

GAS是重要的促胃酸分泌激素，其能促进胃黏膜生长，调节胃蠕动，协助胰腺分泌酶类，帮助肝脏分泌胆汁，并能刺激肠蠕动。有研究发现，脾虚证小鼠胃窦黏膜、十二指肠及下丘脑组织中GAS均减少，而SS均增多[6]。

MTL主要由十二指肠远端及空肠黏膜中M细胞分泌，是一种肽类激素，主要功能是影响胃及肠道的动力，与消化间期综合肌电密切相关，具有肠道“清道夫”的功效；还能刺激胃蛋白酶、胰液的分泌，有助于食物消化。其生理作用主要是促进胃肠运动，提高胃肠道、胆道、Oddis括约肌的收缩力和张力。研究发现，MTL对胃动力的促进作用受下丘脑调控[7]，MTL不足可导致肠平滑肌松弛，胃蠕动减弱，胃排空时间延长[8]，从而产生胃胀、早饱等不适。

SS最初是从羊和猪下丘脑提取液中分离和鉴定的一种生长激素释放抑制激素，存在于胃黏膜D细胞中，以胃窦和胃体部分含量最高，可视为胃黏膜的一种局部防御因子，其作用机理可能是SS与其受体结合，抑制腺苷酸活化酶的活性，降低了细胞内cAMP浓度；SS能抑制胃酸分泌，并且致肥大细胞释放组织胺。SS能抑制多种细胞的分泌、运动、增生[9]，如其能抑制SS、MTL、GAS、VIP等释放，降低胃排空速度，减少肠道平滑肌的收缩，对胃肠道主要起抑制作用[10]。

VIP能引起胃、胆囊平滑肌松弛，肠平滑肌收缩，抑制胃酸分泌，刺激肠道内水和电解质的分泌，扩张外周血管，并在整体上促进了胃肠动力的作用。

本实验结果显示，脾气虚证模型组大鼠随造模时间的延长，小肠组织和血清中GAS和MTL降低，SS和VIP升高，表明大黄枳实厚朴的造模，模拟了脾气虚证时患者出现的纳食减少、食欲不佳、消化能力差、易致停食积食等症状。经过药物干预后，小肠组织和血清中GAS和MTL升高，说明四君子汤具有缩短胃排空时间、提高胃肠平滑肌兴奋性、加强胃蠕动的作用；而小肠和血清中SS和VIP降低，说明四君子汤具有协调脾气虚证大鼠胃肠道动力及胃液分泌的功能。故提示四君子汤能够改善患者出现的纳食减少、食欲不佳、胃动力差、停食积食等症状。作为此次研究重要的检测指标GAS、SS、MTL、VIP，在脾虚证大鼠血清和小肠组织中的活性变化呈现出时相性动态的一致。

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（收稿日期：2014-12-15；編辑：华强）