消痰散结方对MKN—45人胃癌裸鼠原位移植瘤细胞超微结构的影响

叶敏等

摘要：目的 观察消痰散结方对MKN-45人胃癌裸鼠原位移植瘤细胞超微结构的影响，探讨其治疗胃癌的作用机制。方法 采用MKN-45人胃癌细胞株建立裸鼠皮下瘤模型皮下传3代作为实验模型的瘤源，采用0B胶黏合法建立人胃癌裸鼠原位移植瘤模型。40只模型裸鼠分为空白对照组、模型组、消痰散结方组、替加氟组，每组10只。消痰散结方组给予消痰散结方灌胃，替加氟组给予替加氟灌胃，模型组给予生理盐水灌胃，空白对照组正常饮食喂养。干预6周后，测瘤质量，计算抑瘤率。透射电镜观察药物作用后移植瘤细胞超微结构。结果 消痰散结方组瘤质量明显低于空白对照组及模型组（P<0.05，P<0.01），其抑瘤率为46.2%；电镜观察可见胃癌细胞出现典型细胞凋亡的形态学改变。结论 消痰散结方具有诱导MKN-45人胃癌裸鼠原位移植瘤细胞凋亡的作用，提示诱导细胞凋亡是消痰散结方治疗胃癌的可能作用机制之一。

关键词：消痰散结方；胃癌；细胞超微结构；小鼠

DOI：10.3969/j.issn.1005-5304.2015.09.017

中图分类号：R285.5 文献标识码：A 文章编号：1005-5304（2015）09-0060-03

Effects of Xiaotan Sanjie Decoction on Ultramicrostructure in MKN-45 Human Gastric Cancer Orthotopic Xenograft YE Min， SUN Da-zhi， XIU Li-juan， LU Ye， Instructor：WEI Pin-kang （Department of Traditional Chinese Medicine， Shanghai Changzheng Hospital， Second Military Medical University of PLA， Shanghai 200003， China）

Abstract：Objective To observe the effects of Xiaotan Sanjie Decoction on ultramicrostructure in MKN-45 human gastric cancer orthotopic xenograft；To discuss its mechanism for gastric cancer. Methods MKN-45 human gastric cancer cell line was used to establish subcutaneous tumor model in nude mice as an experimental model which passed three generations of tumor source. Then OB glue was used to establish human gastric cancer orthotopic xenograft model. 40 model nude mice were divided into control group， model group （received gavage with saline）， Xiaotan Sanjie Decoction group （received garage with Xiaotan Sanjie Decoction） and Tegafur group （received gavage with Tegafur）， 10 mice in each group. Mice in the control group were under normal diet， without medicine intervention. After 6 weeks of treatment intervention， tumor weight was detected， inhibitory rate was calculated， the ultrastructural changes of gastric cancer cells were detected through transmission electron microscopy. Results The tumor weight in Xiaotan Sanjie Decoction group was significantly lower than that in control group and model group （P<0.05，P<0.01）. The tumor inhibition rate was 46.2%. Under the electron microscope， MKN-45 gastric cancer cells strain changed to typical apoptosis. Conclusion Xiaotan Sanjie Decoction can lead to apoptosis effects on MKN-45 human gastric cancer orthotopic xenografts. All evidences indicate that inducing apoptosis may be one of the most important mechanisms of Xiaotan Sanjie Decoction in treating gastric cancer.

Key words：Xiaotan Sanjie Decoction；gastric cancer；cell ultrastructure；mice

基金項目：国家自然科学基金面上项目（81273910）

通訊作者：孙大志，E-mail：sunda-zhi@163.com

消痰散结方为我科魏品康教授临证40余年经验方，临床治疗胃癌疗效较好[1]。前期实验研究显示，消痰散结方可抑制MKN-45人胃癌裸鼠原位移植瘤的微卫星不稳定、在体外对结直肠癌HCT116细胞有抑制增殖、促进凋亡的作用[2-3]。本实验选取MKN-45人胃癌裸鼠原位移植瘤肿瘤细胞，通过透射电镜观察肿瘤细胞超微结构，进一步明确消痰散结方对胃癌干预的机理。

1 材料与方法

1.1 动物

SPF级雄性裸鼠40只，7周龄，体质量18～20 g，上海斯莱克实验动物有限公司，许可证号SYXK（沪） 2012-0002。实验动物饲养于中国科学院上海实验动物中心动物房的空气层流架内，饲养条件为SPF级。

1.2 细胞株

MKN-45人胃癌细胞株，中国科学院上海生命科学研究院细胞资源中心提供。

1.3 药物

消痰散结方由法半夏、制天南星、全蝎、蜈蚣、茯苓、鸡内金、炙甘草等药物组成，饮片购自上海雷允上公司，消痰散结方原液（含原药材约3.35 g/mL）由本院药材科制剂中心制备；替加氟片，齐鲁制药有限公司，批号206003LD，将其研磨成粉末，溶于生理盐水，浓度为7.8 mg/mL。

1.4 主要试剂与仪器

多聚甲醛，美国Sigma公司；锇酸，美国TED PELLA公司。H-7650型透射电镜，日立（中国）有限公司；UC6型超薄切片机，德国Leica仪器有限公司。

1.5 造模

1.5.1 裸鼠皮下瘤模型建立 0.2 mL MKN-45人胃癌细胞悬液接种于1只裸鼠右侧近腋部皮下，当皮下移植瘤直径长至约1 cm时剥取移植瘤，切成1 mm3瘤块，再经套管针转种至另1只裸鼠腋部皮下，如此反复进行鼠间传代，以第3代皮下移植瘤为实验模型的瘤源[4]。

1.5.2 人胃癌裸鼠原位移植瘤模型的建立 从裸鼠腋下剥取肿瘤组织，剪成1 mm3瘤块备用。实验裸鼠禁食12 h，腹腔注射10%水合氯醛0.03 mL/10 g麻醉，常规手术，在胃大弯近胃窦处用1 mL无菌空针头划破胃壁浆膜层，用无齿镊将破损处向内推压，使局部胃壁形成凹龛，植入一块瘤组织于凹龛内，并在瘤块表面滴OB胶1滴，40 s凝固后将胃壁回纳入腹腔，0号丝线缝合腹膜及皮肤，关腹，复苏。40只荷瘤鼠均复制成功并存活。造模成功后48 h开始给药干预6周。

1.6 分组及给药

选择MKN-45人胃癌原位移植瘤裸鼠40只，随机分为空白对照组、模型组、消痰散结方组、替加氟组，每组10只。替加氟组予替加氟溶液灌胃，消痰散结方组予消痰散结方灌胃，均相当于临床人服用剂量10倍，模型组予等量生理盐水灌胃，灌胃体积0.4 mL/d。空白对照组正常饮食喂养。连续6周。

1.7 观察指标

1.7.1 瘤重及抑瘤率 各组灌胃结束麻醉脱颈处死裸鼠，分离肿瘤，称取瘤重，计算抑瘤率。抑瘤率（%）=（各组平均瘤质量-模型组平均瘤质量）÷模型组平均瘤质量×100%。

1.7.2 移植瘤细胞超微结构 把少量预冷的4%多聚甲醛滴在卡片纸上。用刀片取下一小片瘤组织，用滴管吸取等渗0.9%氯化钠溶液，把血液和组织液冲掉，立即放入卡片纸上的4%多聚甲醛小滴中，然后用新的干净双面刀片把瘤组织切成1 mm?小块，放入装有4%多聚甲醛的小管中浸泡固定。小管置于4 ℃冰箱中保存。脱水、浸透、包埋、聚合、超薄切片、染色，透射电镜观察。

1.8 统计学方法

采用SPSS16.0统计软件进行分析。计量资料以—x±s表示。采用Levene检验进行方差齐性检验，数据资料均方差齐，采用完全随机的方差分析，多个均数的比较用LSD-t检验。检验水准α=0.05。

2 结果

2.1 消痰散结方对瘤重及抑瘤率的影响

称取瘤重，经方差分析，所有实验组差异有统计学意义（P=0.00）。进一步两两比较，空白对照组与模型组、消痰散结方组与替加氟组差异无统计学意义（P>0.05）；消痰散结方组、替加氟组分别与空白对照组、模型组比较，瘤质量明显降低（P<0.05，P<0.05）；消痰散结方组抑瘤率为46.2%，替加氟组抑瘤率为47.3%。结果见表1。

2.2 透射电镜观察结果

空白对照组及模型组肿瘤细胞膜完整，细胞核、线粒体、内质网形态基本正常；消痰散结方组肿瘤细胞细胞膜不连贯，细胞核出现固缩，染色体异染色质聚集，线粒体结构破坏，嵴结构消失，内质网扩张，胞质中出现大量空泡，细胞呈凋亡状态；替加氟组细胞胞质内出现巨大空泡，细胞核固缩，线粒体结构消失，内质网扩张，呈凋亡状态。结果见图1。

3 讨论

胃癌属中医“噎膈”“反胃”“积聚”等病证范畴。魏品康教授总结临证40余年经验，认为胃癌发病机制为六淫入侵、饮食失宜及七情内伤，导致气机阻滞，津液停滞，痰浊内蕴，浸淫细胞，细胞突变，进而结聚为肿瘤。基于对胃癌病因病机“痰本质”的认识，魏品康教授提出胃癌治疗的“消痰散结”法。

消痰散结方由二陈汤合导痰汤化裁而来，方以法半夏、制南星辛温苦燥、善消痰燥湿共为君，天龙、全蝎等解毒散结通络共为臣，陈皮理气和胃、鸡内金助胃之消导而为佐，炙甘草温中健脾、调和诸药为使。本方在消痰药物中辅以理气散结之品，使顽痰得以消散，病因得以根除。

本实验选用替加氟作为阳性药物，替加氟是氟尿嘧啶的衍生物，先在体内经肝脏活化逐渐转变为氟尿嘧啶，再转变为氟尿嘧啶核苷和脱氧氟尿嘧啶核苷，然后才发挥其强有力的对胸腺嘧啶核苷酸合成酶的抑制作用，从而发挥其抗肿瘤活性，在体内干扰、阻断DNA、RNA及蛋白质合成，是一种抗嘧啶类药物。目前临床以5-氟尿嘧啶（5-Fu）为基础的联合化疗作为一线治疗方案，及以替加氟为基础的联合化疗方案，均被证实对胃癌的临床疗效明确[5-6]。并且体外实验研究显示，MKN-45胃癌细胞对5-Fu高度敏感[7]。

本研究发现，消痰散结方对MKN-45人胃癌裸鼠原位移植瘤有明显的抑制作用，消痰散结方组瘤质量明显低于空白对照组及模型组（P<0.05），其抑瘤率为46.2%，抑制作用类似于替加氟组。通过进一步透射电镜观察后发现，消痰散结方组及替加氟组肿瘤细胞均出现凋亡状态，细胞膜不连贯，细胞核出现固缩，染色体异染色质聚集，线粒体结构破坏，嵴结构消失，内质网扩张，胞质中出现大量空泡。在正常细胞代谢活动中，细胞凋亡和增殖处于一个动态平衡状态，当细胞凋亡程序受到抑制就有可能产生肿瘤。研究结果表明，消痰散结方能影响胃癌细胞的超微结构，可诱导其凋亡从而达到抑制胃癌的作用，为消痰散结方干预胃癌的作用机制提供了细胞生物学水平的验证。

参考文献：

[1] 李相勇，魏品康.金龙蛇口服液治疗晚期胃癌的疗效观察[J].湖北中医杂志，2001，23（11）：3-5.

[2] 叶敏，孙大志，魏品康.消痰散结方对MKN-45人胃癌裸鼠原位移植瘤微卫星不稳定的影响[J].中国中医药信息杂志，2013，20（12）：32-34.

[3] 周昱岐，叶敏，吕灿，等.消痰散结方对人结直肠癌HCT116细胞增殖和凋亡及Caspase3蛋白表达的影响[J].中国中医药信息杂志，2015， 22（3）：60-64.

[4] Blumenthal RD. Chemo sensitivity.Volume 2. In vivo models， imaging， and molecalar regulators （Methods in Molecular Medicine）[M]. Totowa：Humana Press，2005：323-335.

[5] Changting Meng， Hongyan Yin， Zhao Sun， et al. Adjuvant chemotherapy with docetaxel， cisplatin， and continuous-infusion 5-fluorouracil for gastric cancer：A phase Ⅱ study[J]. Translational Oncology，2014，7（2）：277-283.

[6] Akira Tsuburaya， Kazuhiro Yoshida， Michiya Kobayashi， et al. Sequential paclitaxel followed by tegafur and uracil （UFT） or S-1 versus UFT or S-1 monotherapy as adjuvant chemotherapy for T4a/b gastric cancer （SAMIT）：a phase 3 factorial randomised controlled trial[J]. The Lancet Oncology，2014，15（8）：886-893.

[7] Chen D， Jiao XL， Liu ZK， et al. Knockdown of PLA2G2A sensitizes gastric cancer cells to 5-FU in vitro[J]. Eur Rev Med Pharmacol Sci，2013，17（13）：1703-1708.

（收稿日期：2015-01-12；編辑：华强）