补阳还五精简方对局灶性脑缺血大鼠脑组织APJ表达的影响

李峰等

摘要：目的 观察补阳还五精简方对局灶性脑缺血大鼠脑组织APJ蛋白和基因表达的影响，并探讨其作用机制。方法 采用大脑中动脉线栓法建立大鼠局灶性脑缺血模型，实验大鼠随机分为假手术组、模型组、补阳还五汤组和补阳还五精简方组，各给药组给予相应药物灌胃。分别于给药第3、7日Western blot、RT-PCR检测各组大鼠脑组织APJ蛋白和基因表达。结果 补阳还五精简方组和补阳还五汤组各时间点APJ蛋白和基因表达均高于模型组和假手术组（P<0.05），补阳还五精简方组与补阳还五汤组各时间点APJ蛋白表达无明显差异，但补阳还五精简方组APJ基因表达高于补阳还五汤组（P<0.05）。结论 补阳还五精简方可通过促进缺血后脑组织APJ的表达发挥对大鼠脑组织的神经保护和修复作用。

关键词：补阳还五精简方；局灶性脑缺血；APJ蛋白；大鼠

DOI：10.3969/j.issn.1005-5304.2015.09.014

中图分类号：R285.5 文献标识码：A 文章编号：1005-5304（2015）09-0048-04

Effects of Simplified Recipe of Buyang Huanwu Decoction on Expression of APJ in Brain of Focal Cerebral Ischemia Rats LI Feng1， WANG Yu-hong2， SHE Yan1， YI Jian3， XIA Xiang-yi1， TAN Hu1， SHAO Le1， CAI Guang-xian3 （1.Hunan University of Chinese Medicine， Changsha 410208， China；2.Key Lab Breeding Base of Hunan Chinese Traditional Medicine Powder and Innovation Drugs Constructed by Provincial Government， Chansha 410208， China；3.Key Lab of Ministry of Education of Internal Medicine Major Diseases Prevention and Achievements Transformation， Hunan University of Chinese Medicine， Changsha 410007， China）

Abstract：Objective To observe the effects of simplified recipe of Buyang Huanwu Decoction on expression of APJ in the brain of local cerebral ischemia rats；To discuss its mechanism of action. Methods Focal cerebral ischemia rat models were established by middle cerebral arterial occlusion. The adult rats were randomly divided into sham-operation group， model group， Buyang Huanwu Decoction group and simplified recipe of Buyang Huanwu Decoction group. Administration groups were given relevant medicine for gavage. The expressions of APJ protein and APJ mRNA at different time points were detected by Western blot and RT-PCR. Results Compared with model group and sham-operation group， the expression of APJ protein and APJ mRNA at different time points in Buyang Huanwu Decoction group and simplified recipe of Buyang Huanwu Decoction group significantly increased （P<0.05）. The expression of APJ protein at different time points showed no difference between simplified recipe of Buyang Huanwu Decoction group and Buyang Huanwu

基金項目：国家重点基础研究发展计划（012CB723503）；湖南省高校创新平台开发基金项目（09k056）；湖南省科技厅项目（2013FJ4211）

通讯作者：蔡光先，E-mail：Cwlwj2008@126.com

Decoction group；while the expression of APJ mRNA in simplified recipe of Buyang Huanwu Decoction group was higher than Buyang Huanwu Decoction group （P<0.05）. Conclusion Simplified recipe of Buyang Huanwu Decoction plays a role in neural protection and restoration by promoting the expression of APJ in the brain of focal cerebral ischemia rats.

Key words：simplified recipe of Buyang Huanwu Decoction；focal cerebral ischemia；APJ；rats

脑缺血可造成大量脑组织损伤，其所致神经功能缺损根本原因是神经细胞损伤。脑缺血时会启动周围组织的修复和再生反应，诱导神经元再生。APJ蛋白是内源性神经肽Apelin的受体，Apelin/APJ能促进神经细胞增殖，可对抗脑缺血后的氧化应激损伤，保护脑组织[1]。补阳还五汤源自《医林改错》，对治疗缺血性中风及其后遗症疗效确切，对缺血性脑中风有显著疗效，补阳还五精简方取补阳还五汤之方义，基于益气祛瘀生新法精简方药而成。课题组前期研究发现，精简方有减小脑缺血后脑梗死面积及减轻脑水肿的作用[2]。本实验采用大脑中动脉线栓法复制大鼠局灶性脑缺血模型，探讨补阳还五精简方对局灶性脑缺血后APJ表达的影响，以期为治疗缺血性脑中风临床用药提供实验依据。

1 实验材料

1.1 动物

SPF级健康成年雄性SD大鼠，体质量250～300 g，北京维通利华实验动物技术有限公司，合格证号SCXK（京）2012-0001。

1.2 药物

补阳还五汤（黄芪120 g，赤芍 4.5 g，川芎3 g，当归6 g，地龙3 g，红花 3 g，桃仁3 g）和补阳还五精简方（黄芪30 g，川芎9 g，地龙6 g），饮片由湖南省中医药研究院提供，符合2010年版《中华人民共和国药典》相关标准。补阳还五汤按传统水煎法浓缩干燥后制备成干浸膏。

1.3 主要试剂与仪器

水合氯醛，天津市科密欧化学试剂有限公司，批号20111114；兔抗大鼠APJ多克隆抗体，Abcam公司，批号AB84296；辣根过氧化物酶标记的山羊抗兔IgG， 上海碧云天生物技术有限公司，批号A0208；BCA蛋白定量试剂盒，Thermo公司，批号PICPI23223；PCR试剂盒、反转录试剂盒，Thermo公司；PCR引物由上海捷瑞合成；RnaseⅠ，Fermentas公司。Image-Pro Express图像分析系统（日本Olympus公司），电泳仪（BIO-RAD 公司，型号mini protean 3 cell），电转仪（PS-9，大连竞迈科技有限公司），芬兰雷勃酶标仪（型号MK3）， FN101-2型鼓风干燥箱（长沙仪器仪表厂）。

2 实验方法

2.1 造模

采用大脑中动脉线栓法复制大鼠局灶性脑缺血模型[3]。假手术组分离左侧颈总动脉后不做切口即缝合。大鼠清醒2 h后参照Bederson[4]的5分制法进行神经功能评分，分值1～3 分者入组。分值越高，神经功能缺损越严重。剔除标准：分值<1分；蛛网膜下腔出血；HE染色无脑缺血病理改变；未到时间点死亡。因大鼠死亡等致样本量不足时随机替补。

2.2 分组及给药

实验大鼠随机分为假手术组、模型组、补阳还五汤组（补阳组）和补阳还五精简方组（精简组），各组每个时间点10只。补阳组术后第1日起予补阳还五汤（相当于干浸膏3.15 g/kg），每日1次；精简组术后第1日起予补阳还五精简方（相当于干浸膏2.41 g/kg）；假手术组和模型组予等量无菌蒸馏水。各组灌胃体积均为0.05 mL/kg。各组大鼠分别于给药后第3、7日脱颈处死。

2.3 Western blot检测脑组织APJ蛋白表达

大鼠水合氯醛麻醉后冰上断头取左侧海马、顶叶皮质放于液氮灌中备用。操作步骤：提取组织蛋白进行蛋白质定量后贮存于-80 ℃冰箱。制备PAGE胶后上样，每孔上样25 μg蛋白进行电泳，半干式转膜，检测膜上蛋白，膜封闭剂抗体孵育后显色，分析图像，进行数据处理。

2.4 RT-PCR检测脑组织APJ基因表达

取材同“2.3”项。引物序列见表1。采用两步法RT-PCR扩增相应片段。反转录合成：42 ℃、1 h， 70 ℃、5 min。PCR反应：94 ℃预变性3 min，94 ℃、30 s，55 ℃、30 s，72 ℃、45 s，35个循环；于72 ℃延伸10 min。取3 μL PCR产物于已加入溴乙锭2%琼脂糖凝胶电泳检测，并用凝胶成像系统摄像分析。

3 统计学方法

采用SPSS19.0统计软件进行分析。所有数据以—x±s表示，组间比较采用方差分析。P<0.05表示差异有统计学意义。

4 结果

4.1 补阳还五精简方对大鼠脑组织APJ蛋白表达的影响

Western blot检测结果显示，假手术组有低水平APJ蛋白表达，各实验组大鼠缺血侧海马组织提取的蛋白均与兔抗大鼠APJ特异性结合，出现阳性条带，大鼠脑缺血后第3日模型组APJ蛋白表达最高，第3、7日精简组和补阳组较同时点模型组APJ蛋白表达升高（P<0.05）。精简组和补阳组间比较无明显差异。结果见图1、图2。

4.2 补阳还五精简方对大鼠脑组织APJ基因表达的影响

假手术组APJ基因表达水平较低，脑缺血刺激后模型组第3、7日表达升高（P<0.05），补阳组表达高于模型组（P<0.05），精简组APJ基因表达高于补阳组（P<0.05）。RT-PCR检测结果显示，目的基因与内参基因溶解曲线集中，只有特异性单峰，表明没有引物二聚体和非特异性扩增，扩增曲线为S型，平行性较好，基线平且无明显上扬。结果见表2、图3。

5 讨论

APJ为血管紧张素Ⅱ1型受体相关蛋白，是有丝分裂原和内源性神经保护肽Apelin的受体[5]。Apelin/ APJ广泛分布于全身组织，在中枢神经系统中有丰富的表达，在大脑皮质、海马神经元、下丘脑、脑室周围结构的器官血管终板等处均有分布[6-7]，對中枢神经系统发挥重要生理作用，可使缺血后脑组织中脑源性神经营养因子表达增高[8]，并能对抗脑缺血后引起的氧化应激损伤，使神经细胞免受氧化应激损害，对海马和大脑皮质神经元具有保护作用。Apelin/APJ能促进多种细胞增殖、分化，也可促进脑缺血后的血管生成和神经细胞增殖[9]。

补阳还五汤为益气活血代表方剂。本课题组前期研究发现，补阳还五汤能明显提高神经细胞的增殖数量，增加神经细胞迁出数和迁移距离，有效促进脑缺血后的神经再生，保护神经功能[10-11]。另有研究显示，补阳还五汤能促进缺血性神经干细胞的增殖和分化[12-13]。补阳还五精简方基于益气祛瘀生新法，秉承“瘀血不去，新血不生”的理念，重用原方中君药黄芪，黄芪不仅大补元气，且能行气，利营卫之气，通营卫之阻滞以活血；川芎行气活血，气行则血行，血行则瘀去脉通也，使气血和顺，“血行风自灭”；加地龙通经活络。诸药合用，使气足以推动血行，瘀去络通。在抗脑缺血损伤方面功效显著，能明显改善大脑中动脉闭塞模型大鼠的神经功能缺失症状，减轻脑水肿，减小梗死面积，有效抗氧化[14-15]。

本实验应用Western blot和RT-PCR方法，发现大鼠局灶性脑缺血后脑组织中APJ蛋白和基因表达均上调，在缺血3 d即达高峰，7 d时仍有高表达。使用补阳还五精简方和补阳还五汤干预后APJ蛋白和基因表达明显升高，均高于模型组（P<0.05），精简组APJ基因表达高于补阳组。这表明补阳还五精简方对脑缺血模型大鼠脑组织的APJ有上调和促进作用，补阳还五精简方可通过激活APJ受体实现脑保护作用，其效果类似甚至优于原方。本实验结果提示，补阳还五精简方激活脑组织中内源性APJ的表达是其发挥对脑缺血损伤保护作用的一个重要机制，而其下游的信号通路有待继续探讨和研究。

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（收稿日期：2015-01-26；编辑：华强）