虾蛄活性肽的分离与纯化及其对肿瘤细胞凋亡的影响

李云涛 卜天 曹玉昊 马剑茵

摘要 [目的] 为海洋抗肿瘤新药的开发提供候选药物。[方法] 以海洋生物虾蛄为原料，采用胰蛋白酶水解提取虾蛄软体组织中的活性多肽，采用超滤、凝胶层析、高效液相色谱等技术对其进行分离与纯化，并选择高表达肿瘤细胞株进行体外抗肿瘤活性评价。[结果] 获得纯度较高的活性肽FHOS，此肽的氨基酸序列为Phe Tyr Met Asn His。采用MTT法测得FHOS对PC3细胞和A549细胞的最高增殖抑制率达到70.1%和90.0%，呈现良好的量效和时效关系。[结论] FHOS具有一定的抑制肿瘤细胞凋亡的活性。

关键词 虾蛄；活性肽；抗肿瘤活性

中图分类号 S986.2 文献标识码 A 文章编号 0517-6611（2015）34-219-03

虾蛄（Oratosquilla oratoria），属于节肢动物门、软甲纲、口足目，在我国南北沿海地区均有分布，是浙江省重要的水产品之一。虾蛄体内的蛋白质含量较高，占总体的16%～20%左右，而生物活性肽就常以非活性形式存在于构成蛋白质的氨基酸长链中。近年来研究表明，口虾蛄乙醇提取物能抑制CNE2Z细胞裸鼠移植瘤的生长[1]，降低CNE2Z细胞的体外侵袭能力[2]。酶解法水解提取海洋生物蛋白条件温和，水解度相对较高，营养成分保留得相对较好，而且从酶解蛋白质产物中分离纯化[3]，经常会得到一些具有生物活性的肽类化合物。笔者以海洋生物虾蛄为原料，运用酶解方法和现代分离技术（膜分离技术、色谱分离技术）提取纯化虾蛄多肽，选择高表达肿瘤细胞株进行体外抗肿瘤活性评价，旨在为海洋抗肿瘤新药开发提供候选药物。

1 材料与方法

1.1 试验材料

胎牛血清，购自杭州四季青生物工程有限公司；四甲基偶氮唑蓝（MTT），購自美国SIGMA公司；F12粉末培养基，购自美国SIGMA公司；RPMI1640 培养基，购自Gibco 公司；二甲基亚砜（DMSO），购自美国SIGMA公司。

1.2 试验仪器

BSZ40LCD 自动部分收集器，为上海琪特分析仪器有限公司产品；岛津PPSQ31A蛋白质测序仪，为日本岛津公司产品；高效液相色谱仪Agilent 1200，为美国Agilent公司产品；超滤杯、超滤膜，购自上海摩速科学器材有限公司； G25凝胶分子筛，购自北京亚太恒信生物科技有限公司。FD1000冷冻干燥机，为上海爱朗仪器有限公司产品； CF16RXII高速冷冻离心机，为日本HITACHI公司产品； UV1100紫外分光光度计为上海美谱达公司产品；ZHJHC1209C型超净工作台，为上海智诚分析仪器制造有限公司产品；酶标仪，美国BioRad公司产品； Forma 3111型CO2培养箱，为美国Thermo公司产品；倒置显微镜，为日本OLYMPUS公司产品。

1.3 细胞株

人前列腺癌细胞PC3、DU145和肺癌细胞A549，由中国科学院上海细胞生物学细胞库提供。

1.4 试验方法

1.4.1 酶解法制备虾蛄多肽粗提物。

取虾蛄并粉碎，调节pH，在水浴保温条件下加入一定量的胰蛋白酶酶解，酶解条件为：pH8.36 ，加酶量0.92%，酶解温度55 ℃， 酶解4 h后将酶解液在100 ℃水浴中灭活15 min，4 000 r/min离心20 min，取上清液浓缩，备用。

1.4.2 MTT法测定抗肿瘤活性[4-5]。

将人前列腺癌细胞DU145、PC3和人肺癌细胞A549分别接种到含有10%胎牛血清和双抗的F12营养液和RPMI1640营养液中，于37 ℃、5%CO2的培养箱中培养。分别取对数期生长的PC3、DU145、A549细胞，用胰酶消化，制成悬液后接种于96孔板内，5%CO2、37 ℃培养24 h，贴壁生长至80%左右，然后弃掉营养液，加入供试虾蛄多肽样本，每个组设置3个平行孔，同时设置不加酶解物的对照组，在5%CO2、37 ℃恒温箱中培养一定时间后，每孔分别加入20 μl MTT和180 μl PBS温育4 h，弃去培养基，加入150 μl的DMSO，在平板摇床上振荡10 min，在酶标仪490 nm处测定吸光度，按照以下公式计算细胞增殖抑制率：抑制率=（1-药物组吸光度值/对照组吸光度值）×100%

1.4.3 虾蛄酶解多肽的分离与纯化。

首先选用超滤法分离，将酶解的粗提物分别用10、5、3 kD超滤膜超滤，分别截留5～10 kD、3～5 kD以及小于3 kD等3个组分，冷冻干燥后分别配成15 mg/ml的浓度，采用MTT法测定各个组分对肿瘤细胞的抑制率。筛选出活性最高的一个组分，选用Sephadex G25凝胶层析，装柱后用去离子水平衡，组分浓度为100 mg/ml，每次上样4 ml，洗脱速度为3 ml/min，流动相为去离子水，于280 nm波长处进行紫外检测。收集洗脱峰，浓缩后冷冻干燥，采用MTT法检测对 PC3细胞、DU145细胞、A549细胞的增殖抑制率，将活性最高的组分大量收集冷冻干燥进行高效液相色谱分离。高效液相条件为：Zorbax SBC18（4.6×250，5 μm）；柱温为20 ℃；流动相为水和乙腈；梯度洗脱：0～40 min，乙腈浓度由0%变化到70%；流速： 0.8 ml/min；紫外检测波长分别为220和280 nm。

1.4.4 多肽的氨基酸序列测定。目标多肽的氨基酸序列分析采用N末端氨基酸降解检测方法测定。

1.4.5 数据处理。所有试验数据均使用SPSS18.0统计软件进行单因素方差分析，结果均以平均值±标准差表示。

2 结果与分析

2.1 虾蛄酶解多肽的膜分离

将浓缩的酶解液经10、5、3 kD的超滤膜粗分离后，得到5～10 kD、3～5 kD以及小于3 kD等3个组分，将各个组分冷冻干燥，配制成15 mg/ml的浓度，反应24 h，各组分对PC3细胞的抑制率分别为25.82%、46.75%和67.80%，对DU145细胞的增殖抑制率为39.72%、45.02%和75.54%，其中组分O3对PC3和DU145细胞的抑制作用效果最好（图1）。

2.2 虾蛄酶解多肽的凝胶层析分离

经过超滤后得到抗肿瘤活性较好的O3组分大量收集，冷冻干燥后选用Sephadex G25凝胶层析洗脱，得到3个组分OS1、OS2、OS3（图2）。

2.3 凝胶层析组分的抗肿瘤活性研究

将各组分分别配成4.0、5.0、6.0、7.0、8.0、9.0 mg/ml的浓度，采用MTT法检测其对PC3、DU145、A549肿瘤细胞的增殖抑制率。培养24 h后由于试验中各组4.0 mg/ml对抗肿瘤细胞的抑制作用较小，所以选为对照组，使用独立样本t检验分析其他浓度组和该组有无显著差异。从图3～5可以看出，3个组分OS1、OS2、OS3对PC3、DU145和A549肿瘤细胞均有一定的抑制性，并且对3种肿瘤细胞的增殖抑制率均呈现出量效关系，其中OS2的抗肿瘤活性最高。对DU145细胞的抑制率要强于PC3细胞和肺癌A549细胞。当DU145浓度为8.0 mg/ml时，对DU145的抑制率达到83.68%，对PC3细胞的增殖抑制率为70.84%，对肺癌A549细胞的增殖抑制率为67.08%。

2.4 高效液相分离组分的抗肿瘤作用

将上述得到的OS2组分进一步经高效液相色谱分离得到3个峰组分，即HOS1、HOS2和HOS3。从图6可以看出，当浓度为0.4 mg/ml时，培养24 h后，对PC3细胞和DU145细胞的增殖抑制率分别为15.52%、17.96%、16.85%和18.54%、21.02%、20.58%（图7）。

2.5 FHOS的结构鉴定

从图8可以看出，组分HOS2对2种肿瘤细胞的增殖抑制作用略强于其他2个组分，将HOS2组分收集并用BEH130 C18色谱柱检测其纯度，在9.81 min出现单一峰，命名为FHOS。经检测该肽的氨基酸序列为Phe Tyr Met Asn His，其分子量为711.80。

2.6 FHOS对PC3细胞和A549细胞的增殖抑制作用

FHOS设置5个浓度组，分别为3、6、9、12和15.0 mg/ml。分别作用24、48、72 h后，采用MTT法測定对PC3细胞和A549细胞的增殖抑制率。从图9～10可以看出，作用72 h后FHOS对A549和PC3细胞的增殖抑制率达到70.1%和90.0%。

3 小结

笔者采用胰蛋白酶水解提取海洋生物虾蛄软体组织中的活性多肽，将酶解得到的粗提物进一步采用超滤、凝胶层析、高效液相色谱等技术进行分离纯化，凝胶层析得到3个组分OS1、OS2和OS3，分别将3个组分对PC3细胞、DU145细胞和肺癌A549细胞进行了抗肿瘤活性的研究，表明3个组分对肿瘤细胞均有很好的增殖抑制活性，并且呈现很好的剂量依赖性，对DU145细胞的增殖抑制率最好。然后，再经过高效液相色谱分离，最终得到一个活性相对较高的虾蛄酶解多肽HOS2。在浓度0.4 mg/ml时，对前列腺癌DU145细胞的增殖抑制率为21.02%。将HOS2通过高效液相检测为单一峰，经质谱分析和N末端氨基酸降解测序，该组分的氨基酸序列为Phe Tyr Met Asn His，其分子量为711.80，命名为FHOS。采用MTT法测定FHOS对PC3细胞和A549细胞的增殖抑制率，呈现很好的量效和时效关系。综上所述，FHOS具有一定的抑制肿瘤细胞凋亡的活性，其体内的抗肿瘤作用及其作用机制还有待于深入研究。

参考文献

[1]

顾帝水，黄培春，孔霞，等.口虾蛄提取物对人鼻咽癌裸鼠移植瘤生长的影响[J].现代中西医结合杂志，2005，14（14）：1825-1826，1828.

[2] 顾帝水，孔霞，黄培春.口虾蛄提取物对人鼻咽癌细胞基质金属蛋白酶-9的抑制作用[J].现代中西医结合杂志，2004，13（21）：2816-2818.

[3] 龚钢明，顾慧，蔡宝国.鱼类加工下脚料的资源化与利用途径[J].中国资源综合利用， 2003（7）：23-24.

[4] WU B，ZHU J S，ZHANG Y，et al. Predictive value of MTT assay as an in vitro chemosensitivity testing for gastric cancer：One institutions experience[J].World J Gastroenterol，2008，14（19）：3064-3068.

[5] BURTON J D.The MTT assay to evaluate chemosensitivity[J].Method Mol Med，2005，110（1）：69-78.