香草兰豆挥发性香气成分比较研究与电子感官图谱绘制

初众　李智　张彦军　姚晶

摘 要 采用感官评定法，结合电子鼻（E-Nose）和顶空固相微萃取-气-质联用（HS-SPME-GC-MS）技术，分析不同产地、年限、等级香草兰豆的挥发性成分，建立香草兰豆种类和品质快速检测方法。结果表明：香草兰豆感官评分由高到低依次为海南2013年一级豆、海南2013年二级豆、科摩罗2013年二级豆、汤加2013年二级豆、海南2012年二级豆、海南2013年三级豆、海南2010年二级豆、海南2011年二级豆。不同产地、年限、等级的香草兰豆挥发性成分的整體信息在电子鼻主成分分析（PCA）图谱中有显著差异。海南2010、2011和2012年二级香草兰豆分别被检测出65、60和62种挥发性成分，相对含量最多为香草醛，分别为60.00%、57.00%、62.78%；不同种类香草兰豆的芳香族类、醛类、酮类、酸类、醇类、杂环等六大类香气化合物相对含量有明显差异。在此基础上绘制电子鼻指纹图谱，利用电子图谱可以快速区分香草兰豆的种类和品质。

关键词 香草兰豆；感官评定；电子鼻；顶空固相微萃取-气相-质谱联用

中图分类号 TQ651 文献标识码 A

Abstract The quality and the aromas of vanilla pods were investigated based on different origins， years， levels. In addition， a rapid detection method of cultivars and quality for vanilla pods was established by sensory evaluation coupled with E-Nose and HS-SPME-GC-MS. The results showed that the sensory scores of vanilla pods decreased as the primary level of 2013 from Hainan>the secondary of 2013 from Hainan> the secondary of 2013 from Comoros> the secondary of 2013 from Tonga> the secondary of 2012 from Hainan>the secondary of 2013 from Hainan> the secondary of 2010 from Hainan> the secondary of 2011 from Hainan. Overall aroma of different origins， years， levels of vanilla pods could be significantly distinguished by principal component analysis（PCA）of E-Nose. 65， 60 and 62 kinds of volatile components were detected for the secondary of 2010， 2011， 2012 from Hainan， respectively. The highest component of vanillin corresponded to 60.00%， 57.00%， 62.78%， respectively. Significant differences existed among the relative contents of aromatic compounds， aldehydes， ketones， acids， alcohols， heterocyclic from different vanilla pods. Electronic nose map were made on the basis of above results and could be used to distinguish vanilla pods species and quality quickly.

Key words Vanilla pods； Aroma； Electronic Nose； HS-SPME-GC-MS

doi 10.3969/j.issn.1000-2561.2015.11.030

香草兰（Vanilla planifolia Andrews）又称香子兰、香荚兰、扁叶香草兰、哗呢拉等，是名贵的多年生热带藤本香科植物，有“食品香料之王”的美誉[1]。其鲜豆荚通过杀青、发酵、阴干、后熟等工艺可被加工成商品香草兰豆，含有250多种挥发性香气成分，用途广泛，其酊剂和香膏主要作为食品香料应用于冰激凌、巧克力、糖果等食品行业；也可用于化妆业、烟草业或制造高档香水和香烟。此外，香草兰在医药、保健等行业也被广泛关注，有补肾、健胃、健脾、安神等功效[2-4]。

香草兰主要分布于马达加斯加、印度、汤加、科摩罗和墨西哥等热带和亚热带地区的国家，中国于20世纪60年代从斯里兰卡引种成功，只有海南省和云南省适宜种植。香草兰豆在国际市场一直供不应求，价格昂贵，每千克达到60～80美元，且需求量仍以每年2%递增[3]。香草兰豆挥发性成分的种类和含量与其生长环境和加工方式密切相关，不同国家的香草兰豆挥发性成分差异较大[5]，而关于不同种类、品质的香草兰豆还没有建立简单、高效的检测方法和统一的评定标准。感官评定是用于判定食品颜色、质地、挥发性风味等的一种简单、快速、有效的方法，能解决一般理化分析所不能解决的复杂生理感受问题，但由于感官评定易受人的心里和生理影响，缺乏稳定性，会使得实验结果出现一定的偏差[6]。而电子感官分析技术（电子鼻、电子舌）具备集成的高端指纹分析软件，能对结果进行直接判断，电子鼻通过传感器阵列和模式识别技术能敏感地识别气味指纹及其变化，可以客观、快捷地对食品中的复杂风味和多种挥发性成分进行分析、识别和检测[7]。固相微萃取-气质-联用方法因具有操作时间短、节约样品、无需萃取溶剂、挥发性物质损失小、能较为真实地反映样品风味成分等优点而被广泛应用于香气成分的分析[8]。Malagash等[9]用感官评定结合电子鼻分析，发现改进方法发酵得到的波旁和墨西哥香草兰香味与未改进方法发酵的香草兰香味存在明显差异。朱潘炜等[10]通过建立GC-MS指纹图谱，鉴别了不同年份成品黄酒，从而使年份黄酒生产标准化。Cheng等[11]用GC-MS结合电子鼻主成分分析来识别蜂胶产地。然而，关于利用感官评定、电子感官和固相微萃取-气质-联用技术相结合的方法来研究香草兰豆挥发性成分的研究尚未见报道。

本研究先采用感官评定对不同产地、年限、等级的香草兰豆进行品质鉴定，接着通过电子鼻PCA图谱呈现样品整体挥发性信息的差异情况，然后用HS-SPME-GC-MS来解析验证电子鼻主成分分析对样品区分的有效性，为香草兰豆种类的区分、品质的检测提供理论依据。

1 材料与方法

1.1 材料

1.1.1 试验材料 香草兰豆荚由中国热带农业科学院香料饮料研究所提供，实验选取8种香草兰豆样品（1号：海南2013年一级豆；2号：海南2013年二级豆；3号：海南2013年三级豆；4号：科摩罗2013年二级豆；5号：汤加2013年二级豆；6号：海南2010年二级豆豆；7号：海南2011年二级豆；8号：海南2012年二级豆），所有香草兰品种均为Vanilla planifolia Andrews，其中，海南产豆荚采用单元式热空气技术发酵生香。

1.1.2 仪器与试剂 气相色谱-质谱仪 7890A-5975C（美国Agilent公司）；固相微萃取纤维头75 μm CAR/PDMS（美国Supelco公司）；手动固相微萃取装置（美国Supelco公司）；电子鼻分析系统（法国Alpha M.O.S公司）；C7～C30烷烃标样（美国Sigma公司）。

1.2 方法

1.2.1 感官评定方法 加权评分法[12]：对同一种食品，由于各种指标对其质量的影响程度不同，它们之间的关系不完全是平权的，因此，需要考虑它的权重，所谓加权评分法是考慮各指标对质量的权重后求平均分数或总分的方法，加权评分法比评分法更加客观公正，因而可以对产品的质量做出更加准确的评价。参照表1的评定指标对各样品进行打分。

香气和色泽状态的评分法：由从事过香草兰研究的专家和经过香草兰知识培训的人员共10名，在室温（25 ℃），于日光灯下进行品评，参照表1对各样品进行打分，每个样品平行试验3次。豆荚长度评分方法：用刻度尺重复测量3次，参照表1对样品进行打分。

1.2.2 电子鼻分析条件 测定方法参考刘红等[13]的方法作适当修改。分别称取待测香草兰豆粉末样品1 g装入10 mL顶空瓶中，加盖密封待检；将制备好的装有样品的顶空瓶分组放入待测样品盒中，设置检测程序，由G6500-CTC自动进样器取样检测，每个待测样品制备10个平行样。本研究所使用的电子鼻配备6支金属氧化物传感器，电子鼻检测参数为载气，净化空气；样品量：1 g；流速：150 mL/min；样品容器容积：10 mL；注射器温度：60 ℃；注射体积：1 500 μL；孵化温度：50 ℃；孵化期：300 s；数据采集延迟时间为180 s；数据采集时间：90 s。

1.2.3 HS-SPME条件 在改进课题组成员董智哲[5]的方法后进行试验。准确称量2 g粉碎后的香草兰豆粉末于15 mL固相微萃取瓶中，加盖密封后将其置于80 ℃水浴锅中预热20 min；再用CAR/PDMS（75 μm）纤维头吸附20 min；在气质进样口解吸附8 min，解吸附温度为250 ℃。样品平行试验3次。

1.2.4 GC-MS条件 色谱柱：DB-5MS毛细管柱（30 m×0.25 mm×0.25 mm）；升温程序：起始温度40 ℃，保持2 min，然后以1.5 ℃/min的速率升温到65 ℃，保持2 min，再以0.5 ℃/min的速率升温到70 ℃，以5 ℃/min的速率升温到90 ℃，以3 ℃/min的速率升温到170 ℃，最后以4 ℃/min的速率升温到290 ℃并保持2 min；载气为He；流速为1 mL/min，不分流进样。质谱条件：电离方式为EI；离子源温度为230 ℃；四极杆温度为150 ℃；接口温度280 ℃；扫描范围为m/z 30～300。各样品平行试验3次。

1.3 数据分析

GC-MS数据分析：利用仪器配置的NIST 08谱库对各组分进行检索，根据匹配度与文献已报道的物质进行核对，再与文献报道的DB-5MS柱的保留指数（retention index，RI）值比对（定性分析）；同时采用峰面积归一化法进行定量，得到各组分的相对含量（组分峰面积占总峰面积的百分比）。电子鼻数据分析：采用Alpha Soft V12.0软件控制仪器和处理数据，用Origin8.0软件作图。

2 结果与分析

2.1 感官评定结果

（1）权重的确定。所谓权重是指一个因素在被评价因素中的影响和所处的地位。根据相对重要性对各个因素进行重要性比较，据此得到每个评委对各个因素所打的分数（表2）。

（2）加权评分。10个评委分别对8种样品的香气、色泽状态、豆荚长度进行评分（参照表1），其中长度评定所得结果见表3，香气、色泽状态评定结果见表4。每个样品平行试验3次。

样品得分为各因素得分乘以对应权重比重的总和，即10个评委的评分和相加，满分100分。以1号样品为例，1号样品总分：A评委评分（7×80%+8×10%+8×10%）+B评委评分（8×70%+9×15%+7×15%）+C评委评分+…+…J评委评分=86.64分；其它样品得分算法同上，结果见表4。

样品评分结果由高到低的顺序为：海南2013年一级豆﹥海南2013年二级豆﹥科摩罗2013年二级豆﹥海南2012年二级豆﹥汤加2013年二级豆﹥海南2013年三级豆﹥海南2010年二级豆﹥海南2011年二级豆。

2.2 香草兰豆电子鼻分析

电子鼻分析得到的不是被测样品中某几种成分的定性与定量结果，而是样品中挥发成分的整体信息，也称指纹数据[14]。通过统计学方法对数据进行分析，可以更直观地看出不同等级豆挥发性成分的差别。电子鼻的主成分分析（principle component analysis， 简称PCA）是一种多元统计方法，通过掌握事物主要矛盾，把样品反映到传感器上的多指标的信息进行数据转换和降维，并对降维后的特征向量进行线性分类，最后在PCA的散点图上显示主要的两维散点图[15]。在PCA转换和降维后，通过线性分类获得的综合指标即为主成分，方差贡献率较大的第1主成分和贡献率次之的第2主成分的合计方差贡献率达到85%以上，则说明主要成分可以较好地反映原来多指标的信息[16]。

图1、图2、图3分别是年限和等级相同不同产地、产地和等级不同年限、产地和年限相同不同等级的香草兰豆挥发性成分信息电子鼻PCA图谱。由图1至3可知，不同的香草兰豆样品分布在电子鼻PCA图谱的不同区域，同一样品的9组平行数据很好地组成群落（删掉了误差较大的点），说明实验平行性较好。3幅图的第一主成分轴（PC1）和第二主成分轴（PC2）累计方差贡献率分别为99.64%、99.95%、99.94%，说明2个主成分轴包含了香草兰豆挥发性成分的大部分信息量，能够反映香草兰豆挥发性成分的整体信息。由此可见，不同产地、年限、等级的香草兰豆挥发性信息通过电子鼻系统可以很好地区分，并且清晰地表达在电子鼻PCA图谱上。

2.3 香草兰豆挥发性物质分析

香草兰课题组成员董智哲[5]用顶空固相微萃取方法分析了海南、汤加、科摩罗香草兰豆的挥发性物质，结果显示不同产地香草兰豆种类和相对含量有较大差异。通过前期研究结果，论证了海南产不同等级的香草兰豆挥发性成分的种类和相对含量差异显著[17]。

通过HS-SPME-GC-MS对不同年限香草兰豆挥发性物质进行分析，共检测出70种挥发性成分（表5），其中海南产2010年、2011年、2012年香草兰豆分别检测出65，60和59种。利用面积归一化法进行定量分析，结果显示这3种香草兰豆中相对含量较高（大于0.8%）的物质主要有2，3-丁二酮、乙酸、3-羟基-2-丁酮、正己醛、（E）-2-庚烯醛、4-羟基-3-甲氧基苯甲醛（也叫香草醛）、呋喃甲醛、3-蒈烯、右旋萜二烯、苯甲醛等，其中相对含量最多的为4-羟基-3-甲氧基苯甲醛，在2010、2011和2012年豆中分别为37.68%、39.97%、34.40%。有些挥发性物质只在2010年香草兰豆中被检测到，如3-甲基丁醛、4-甲基苯酚、3，5-辛二烯-2-酮、4-甲氧基苄醇、壬酸、十四酸；2，3-二甲基吡嗪只在2011年香草兰豆中含有；2012香草兰豆中没有检测到特有物质。

对不同年限香草兰豆检测出挥发性化合物进行分类总结，结果如表6所示。海南产2010年香草兰豆被检测出芳香族18种、醛类13种、酮类7种、酸类5种、醇类6种、杂环9种、烷烃6种和酯类2种；2011年豆依次为14、11、8、4、5、11、5和2种；2012年豆依次为18、11、8、4、4、8、7和3种。各类化合物中芳香族类相对含量最高，在2010、2011和2012年豆中分别为69.82%，63.06%和75.16%。此外，2010年豆的醛类和杂环化合物相对含量最多，分别为9.25%、8.97%；2011年豆的酮类、酸类、醇类和烷烃类相对含量最多，分别为7.12%、5.52%、5.87%和2.25%；而2012豆的芳香族类和酯类相对含量最高，分别为75.16% 和0.13%。

通过上述分析可知，无论是不同产地、不同年限还是不同等级的香草兰豆，挥发性物质都有所不同，这主要是受豆荚的生长环境、豆荚的生香加工方式的影响，此外，豆荚的外观状态也会影响内部生香过称。也就是说，正是由于不同类香草兰豆挥发性物质的不同，才导致香草兰豆挥发性成分在电子鼻PCA图谱上呈现的整体信息有区别，二者相互验证。在香草兰豆中香草醛是最重要的香气化合物，对香草兰豆整体香气有高达1/3的贡献率[21]，在不同产地、年限、等级的香草兰豆中，海南2013年二级豆、海南2012年二级豆、海南2013年一级豆香草醛相对含量最高[5，17]。而感官评分中，所有香草兰豆中香气所占的权重最大，香草醛含量相对高的海南2013年二级豆、海南2012年二级豆、海南2013年一级豆的评分也最高，二者也相互验证。

2.4 香草兰香气电子感官图谱建立

香草兰豆挥发性成分的电子鼻指纹图谱如图4所示，不同样品的平行数据聚集成群落，说明实验重复性良好。第一主成分轴方差贡献率为95.865%，第二主成分轴方差贡献率为3.776%，2个主成分轴累计方差贡献率为99.641%，说明主成分轴能较好地反映样品多指标的信息量，不同香草兰豆的香气信息在电子鼻PCA图上充分表达和区分。不同产地的香草兰豆在图上区分明显，汤加和科摩罗香草兰豆的香气信息在靠近第一主成分轴表达，而海南不同年限和等级的香草兰豆香气信息集中在图谱的中部和上部表达。结合感官评分可知，感官评分最高的2013年一级豆和2013年二级豆分布在指纹图的最上部，评分最低的海南2010和2011年二级豆分布在指纹图谱中间。由此可知，图谱上的样品挥发性物质信息分布在种类和品质上有规律性，对于未知样品，只要通过电子鼻进样，把信息导入已知谱库即可获取未知样品的产地分布、年限、等级、品质等信息，简单快捷。

3 结论

感官评定得出的样品评分结果由高到低顺序为：海南2013年一级豆﹥海南2013年二级豆﹥科摩罗2013年二级豆﹥汤加2013年二级豆﹥海南2012年二级豆﹥海南2013年三级豆﹥海南2010年二级豆﹥海南2011年二级豆。利用电子鼻PCA图谱对样品挥发性物质的整体信息进行显著区分，并且通过顶空固相微萃取-气-质联用技术对样品的挥发性成分进行分析，其相对含量和种类差异显著，结果与电子鼻系统呈现的信息相互验证，获得了能代表香草兰豆种类和品质信息的电子感官图谱，建立了快捷、客观的香草兰豆种类和品质的快速检测方法。

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