米易鸡ADSL基因第2和第9外显子多态性与肌苷酸含量的关联

石浩　徐亚欧　梅寒　王海　刘红丽　左斌　聂晓庆　胡卫民

摘要：为了检测米易鸡ADSL基因第2、第9外显子的单核苷酸多态性并分析该多态性与胸肌肌苷酸含量的关联性，以四川省优质地方鸡种米易鸡为研究对象，采用高效液相色谱测定米易鸡胸肌肌肉肌苷酸的含量，并运用测序技术测定了ADSL基因第2、第9外显子的单核苷酸多态性。结果表明：ADSL基因在外显子2（A3713G、C3797T），外显子9（C10191T）处出现3个SNP位点，变异引起相应的氨基酸均为同义变异，第2外显子A3713G位点的基因型为AA、GG、AG型；C3797T位点的基因型为CC、CT、TT型；第9外显子的C10191T位点的基因型为CC、CT型。经独立性检验，ADSL基因A3713G、C10191T位点变异处于Hardy—Weinberg平衡状态；应用最小二乘法对基因型与肌苷酸含量进行分析，说明ADSL第9外显子C10191T SNP位点与IMP含量存在显著相关性（P<0.05），CT型个体的胸肌肌苷酸含量高于cc型个体，初步推测米易鸡中ADSL基因第9外显子C10151T SNP位点CT型为优势基因型。

关键词：米易鸡；肉质风味；育种改育；肌苷酸（IMP）；ADSL基因；SNP；外显子2；外显子9；多态性；相关性

中图分类号：S831.2 文献标志码：A 文章编号：1002-1302（2015）05-0029-03

目前国内外的大量研究表明，鸡肉内的肌苷酸含量在很大程度上影响其肉质风味及性状，但是肌苷酸含量又受多种因素的影响，常规选育进展较慢，因此利用与肌苷酸含量相关的候选基因，应用分子标记辅助选择加快遗传研究进展是当前较为有效的手段，可以在分子水平对肉鸡的肉质风味进行育种改良。肌苷酸（inosine monophosphate，IMP）是衡量肌肉肉质风味性状的重要指标之一，在体内肌苷酸从头合成过程涉及10种关键酶，这10种关键酶由5个基因编码，即（；PAT基因、AIRC基因、ADSL基因、GARS-AIRS-ART基因、PURH基因。其中ADSL基因是嘌呤核苷酸合成过程中的关键酶之一，催化2个重要反应：（1）由氨基咪唑琥珀基氨甲酰核苷酸（sACIAR）生成氨基咪唑氨甲酰核苷酸（AICAR）的反应；（2）由腺苷酸琥珀酸生成腺苷酸单磷酸的反应，这2个反应对于最终的肌肉肌苷酸含量具有重要的影响。Aimi等克隆了鸡ADSL基因的cDNA全长序列并将其定位于1号染色体上，长15 593 bp，包含13个外显子和12个内含子，转录为长1520bp的mRNA（NM-205529.1），翻译成含有459个氨基酸的蛋白质序列（NP-990860.1）。季从亮以ADSL基因作为IMP含量的候选基因，对5'侧翼序列、所有外显子和部分内含子单核苷酸多态位点进行检测，共检测到5个SNP位点，并发现部分突变位点与胸肌肌苷酸含量相关。

“米易鸡”是四川省的优良地方鸡种之一，其体型较大，具有早期生长速度快、肉用性能较好、性情温顺、便于饲养管理、肉质风味佳等优点。为研究米易鸡肉质风味好的特点，本研究拟采用测序技术检测米易鸡ADSL基因外显子9的单核苷酸多态性，并与米易鸡肌苷酸含量问进行关联研究，以探讨在米易鸡内ADSL基因第2、第9外显子的多态性与肌苷酸含量问的关系，为米易鸡的优良肉质风味选育提供理论依据。

1.材料与方法

1.1试验动物

于四川省攀枝花市米易鸡专业养殖户购入脱温鸡苗64羽（公母各半），全阶段由专人管理，单笼饲养，管理和营养水平一致，自由饮食。分别在81、119、153、210d进行屠宰性能测定，真空采血管（EDTA·K2抗凝，江苏康健医疗用品有限公司生产）翅下静脉采血，每羽采血约2mL，置于-20℃冷冻保存备用。屠宰时同时采集胸肌和腿肌，-80℃保存备用。

1.2试验方法

1.2.1血液中DNA提取和检测

用AXYGEN血液基因组（Axygen公司生产）DNA提取试剂盒提取血样中的基因组DNA，经PCR仪（型号：AG22331 Hamburg，德国Eppendoff公司生产）扩增、琼脂糖凝胶电泳（电泳仪型号：DYCP-31DN型，北京六一仪器厂生产）和紫外一可见分光光度计（型号：Cary 50，美国Varian公司生产）检测纯度，-20℃保存备用。

1.2.2引物设计、PCR扩增及测序

根据笔者所在实验室对ADSL基因的研究结果及ADSL基因信息（GenBank登录号：AY665559），用Primer5.0设计特异性引物，由上海英骏生物技术有限公司合成，扩增该基因含有SNP位点的第2、第9外显子特异性序列，引物序列及产物片段长度见表1。

PCR扩增体系（25uL）为：9.5uL超纯水（超纯水系统型号：艾柯AKHL—III一24，成都康宁实验专用纯水设备厂生产）、各1μL上下游引物（10μL，浓度10umol/L，上海英骏生物技术有限公司合成）、1uL DNA模板（100ug/uL）、12.5uLMaster Mix[天根生化科技（北京）有限公司]。

PCR扩增程序为：94℃预变性5min；94℃变性30s，52℃/57℃复性30s，72℃延伸30s，30个循环；72℃延伸7min。扩增产物经1.5%琼脂糖凝胶电泳检测PCR产物的亮度和纯度。根据琼脂糖凝皎电泳检测结果，将所有PCR产物送至上海英骏生物技术有限公司进行双向序列测定。

1.2.3肌苷酸含量的测定参照陈国宏等的高效液相色谱法”叫测定肌肉肌苷酸含量。

2.结果与分析

2.1鸡基因组DNA抽提结果

从试验鸡群血液中提取基因组DNA，使用1.5%琼脂糖凝皎电泳检测，与相同上样量的DL2000 marker[天根生化科技（北京）有限公司]比较。图1结果显示，条带清晰明亮，大约40kb]，且无扫尾现象，浓度较均匀，表明所提取DNA质量较好，含杂质较少，完全符合PCR试验要求。

2.2 PCR扩增结果

利用1.5%琼脂糖凝胶电泳分别对ADSL基因第2、第9外显子扩增片段进行检测，由图2、图3可见，在279、255 bp处分别呈现出1条特异性的条带，表明引物特异性较好。

2.3测序结果

将PCR扩增的特异片段进行测序，通过测序反应检测到米易鸡ADSL基因第2外显子存在A3713G、C3797T变异，第9外显子存在C10191T变异，但都未引起相应氨基酸的变异。由图4、图5、图6的测序结果可知，米易鸡ADSL基因第2外显子A3713G位点的基因型为AA、GG、AG型；C3797T位点的基因型为CC、CT、TT型；第9外显子的C10191T位点的基因型为CC、CT型。

2.4 ADSL基因第2、第9外显子突变位点的基因和基因型频率分析

统计ADSL基因第2、第9外显子的变异在米易鸡中的基因频率、基因型频率及检验分析结果。由表2结果可见：米易鸡中ADSL基因第2外显子A3713G、第9外显子C10191T的SNP位点在试验群体中均处于Hardy-Weinberg平衡状态2.5 ADSL基因第2、第9外显子的SNP位点的基因型与胸肌IMP含量的相关性分析

对ADSL基因第2外显子A3713G、C3797T和第9外显子C10191T SNP位点的基因型和IMP含量进行差异显著性检验。表3结果表明：ADSL基因第2外显子中的各基因型与胸肌IMP含量差异都不显著；ADSL基因外显子9（C10191T）中CT杂合子个体胸肌的IMP含量最高，显著高于cc型个体胸肌的IMP含量（P

3.讨论与结论

3.1 ADSL基因的多态位点

季从亮扫描了ADSL基因含5'侧翼序列在内的所有的13个外显子以及部分内含子序列，并进行了SNP位点检测，结果共检测出5个SNP位点，其中2个位于外显子区域，3个位于内含子区域，结果仅有外显子9处存在C9839A突变为非同义突变，导致了甘氨酰胺核苷酸合成酶氨基酸序列的第173处发生氨基酸的变异：脯氨酸（Pro）变异为苏氨酸（Thr）。张学余等对隐性白羽鸡、丝羽乌骨鸡、萧山鸡、白耳鸡、藏鸡ADSL基因的外显子9的研究发现了相同突变位点，并发现可引起氨基酸变异。而本研究通过对米易鸡的ADSL基因外显子9的检测发现，在C10191T处发生突变，翻译氨基酸序列后比对发现第286处的亮氨酸（Leu）发生变异，表明该突变为同义突变。龚琳琳对皋鸡、安卡鸡、文昌鸡、隐性白羽肉鸡4个群体的ADSL基因外显子9的检测中也得到了同样的结果。

束婧婷等发现，在ADSL基因外显子2的A3713G、C3484T处发生了突变，但2个突变位点都没有引起相应的氨基酸发生改变。本研究也是在外显子2的A3713G、C3797T处检测到突变位点，分别翻译甘氨酰胺核苷酸合成酶氨基酸序列后比对发现，在第59处的亮氨酸（Leu）和第87处的丝氨酸（ser）都未发生变化，表明2种突变都是同义突变，都没有引起相应的氨基酸变异。

3.2ADSL基因第2、第9外显子SNP位点的基因型和胸肌IMP含量的相关性

张学余等在ADSL基因外显子9的C9839A处发现突变，通过对5个鸡种该突变位点的基因型与肌苷酸含量的相关性分析表明：在5个鸡群体中的基因型分布差异显著，除了萧山鸡与丝羽乌骨鸡之间基因型分布差异不显著之外，其余各鸡种两两之间均存在显著或极显著的基因型分布差异（P<0.05或P<0.01），初步推测该位点的基因型频率分布与品种有关，但进一步方差分析并没有显示出该位点的多态性与胸肌的IMP含量之间存在关联。束靖婷等通过对ADSL外显子2的C3484T突变位点与肌苷酸含量的相关性分析，表明ADSL基因中TT型个体胸肌IMP含量较cc型高出O.880mg/g，达到极显著水平（P<0.01），TT型个体IMP含量较CT型高出0.758mg/g，达到显著水平（P<..05），CT型个体IMP含量稍高于CC型，但二者之间差异不显著。

而本研究对米易鸡ADSL基因第2、第9外显子SNP位点研究结果表明，虽然3个突变位点都没有引起相应的氨基酸变异，但其中外显子9的C10191T突变位点中的CT杂合子个体胸肌的IMP含量最高且都高于其他基因型个体胸肌的IMP含量，达到显著水平（P<0.05），说明该位点的变异对胸肌的IMP含量变化有较显著的影响。米易鸡中ADSL基因第9外显子C/T（C10191T）sNP位点CT型为优势基因型，虽然未检测到TT型，但是可以推测TT型是C基因突变为T的结果。

由此可见，ADSL基因外显子9处的基因突变对胸肌IMP含量的影响在不同的鸡种之间的表现不完全一致。鸡ADSL基因不同外显子的不同变异，在不同鸡种中的变异不尽相同，且与鸡胸肌IMP含量之间的调控模式关系也还不清楚；因此，今后有必要选择具有代表性的鸡种，大大增加测定样本，对ADSL基因的全部变异位点进行扫描，方可弄清ADSL基因对鸡胸肌IMP含量之间的调控模式。