黄连生物碱的提取及抗肿瘤抑菌活性研究

文 / 麻 慧* 朱军强（兰州理工大学生命科学与工程学院，甘肃兰州 730050）

基金项目： 国家农产品质量安全风险评估项目（GJFP2015014）

黄连生物碱的提取及抗肿瘤抑菌活性研究

文 / 麻 慧* 朱军强（兰州理工大学生命科学与工程学院，甘肃兰州 730050）

基金项目： 国家农产品质量安全风险评估项目（GJFP2015014）

本实验通过醇水法提取黄连中总生物碱，优化了其提取工艺，并研究了生物碱对肿瘤细胞和细菌的活性的影响。在提取的过程中以乙醇浓度、料液比、提取时间和提取次数为单因素来研究各因素对提取率的影响。在单因素验实验的基础上采用正交法进行实验，优化提取工艺。实验结果表明提取的最优条件为：乙醇浓度75%、料液比1:15、提取时间1.5h、提取次数2次。分别采用M TT法和抑菌圈实验研究黄连总生物碱对HepG2肿瘤细胞及大肠杆菌、金黄色葡萄球菌和枯草芽孢杆菌的抑制性。结果表明，黄连总生物碱具有较强的抑制H epG2肿瘤细胞及细菌生长的特性。

黄连，生物碱，抗肿瘤，抑菌性

黄连为多年生草本植物，属毛茛科黄连属。黄连含有多种生物碱，具有清热燥湿，泻火解毒的作用[1]。黄连和盐酸小 碱具有抗病原微生物、抗腹泻、抗炎等药理作用[2]。本实验采用正交实验法优化了黄连中生物碱的提取工艺，并研究了生物碱对肿瘤细胞和细菌生长的影响。

1、材料和方法

1.1 样品材料

实验所用的样品是由市购的黄连，将样品粉碎后过40目筛，然后用于实验；大肠杆菌，金黄色葡萄球菌，枯草芽孢杆菌由生命学院实验室提供；实验所用的肿瘤细胞是HepG2(人肝癌细胞)。

1.2 实验方法

1.2.1 对照品的配制

称取盐酸小 碱标准品5mg，配制成标准溶液，以体积分数95% 的乙醇为空白，在紫外光最大吸收波长345nm 处测定吸光度，以标准溶液质量浓度为横坐标，吸光度为纵坐标绘制标准曲线[3]。得回归方程为y=9.0286x-0.0005，R2=0.9999。

1.2.2 单因素实验设计

称取粉碎后的黄连样品0.5g，分别选择乙醇体积、料液比、提取时间和提取次数为单因素，确定最佳的提取条件。

1.2.3 正交实验的设计

通过在单因素实验中对不同因素的实验，分析各种参数对于提取率的影响，确定最佳的实验条件，进行正交实验。对照单因素实验结果，以影响总生物碱提取率的乙醇体积分数、回流提取时间、料液比、提取次数为4个影响因素，许沛虎等[6]也通过这几个因素优选出最佳工艺。3个水平L9(34)进行正交实验，优选最佳提取工艺。因素水平见下表1。

表1 正交实验因素水平Table 1 Factors of Orthogonal experiment

1.2.4 黄连总生物碱的抗肿瘤活性及抑菌性研究

采用M TT法测定黄连生物碱对肿瘤细胞增殖的抑制作用。实验所选菌株为金黄色葡萄球菌、枯草杆菌和大肠杆菌。

2、结果与分析

2.1 单因素实验

2.1.1 乙醇体积分数对提取率的影响

通过单因素实验，分别获得了不同乙醇体积分数、不同的料液比、不同提取时间、不同的提取次数对总生物碱提取率的影响，见图1。

图 1 各种因素对提取率的影响Figure 1 Effects on extraction rate

2.2 正交实验结果分析

表2 正交实验结果分析表Table 2 Analysis of orthogonal experiment

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影响提取率的因素顺序为D>B>C>A，即提取次数>料液比>提取时间>乙醇浓度。最佳工艺为：乙醇浓度75%，料液比1:15，提取时间2h，提取次数3次。结合提取时间对提取的影响，实际提取工艺为：乙醇浓度75%，料液比1:15，提取时间1.5h，提取次数3次。

2.3 黄连生物碱的抗肿瘤活性的研究

抑制率的计算公式：

图6 不同浓度生物碱对肿瘤细胞的抑制作用Figure 6 Inhibitory effect of different concentration alkaloids on tumor cells

2.4 生物碱的抑菌性

样品中提取的总生物碱不同浓度溶液体外三种菌体的抑菌圈直径（cm）如下表3

表3 三种菌体的抑菌圈直径Table 3 Diameter of antibacterial circle of three bacteria

从表中的数据可以看出，总生物碱对三种菌体的抑制性强弱为：金黄色葡萄球菌＞枯草杆菌＞大肠杆菌。在浓度范围为2-8m g/m L的范围内对细菌的生长有显著的抑菌效果，具有统计学意义。

3、结论与讨论

本实验主要通过对提取工艺中的四个主要对提取率有影响的因素的探究，确定提取生物碱的最优条件为：乙醇浓度75%，料液比1:15，提取时间1.5h，提取次数3次。生物碱对肿瘤细胞的生长有明显的抑制效果，抑制性随时间的增长而增强；生物碱对三种细菌的抑菌强弱为：金黄色葡萄球菌＞枯草杆菌＞大肠杆菌。

小 碱抗肿瘤作用具有很广泛的应用性[6]。但目前有关小 碱抗肿瘤作用的具体机制尚有许多地方不清楚，如小 碱对机体免疫功能、淋巴细胞活性的影响，抑制肿瘤细胞增殖，到底是阻滞于G0/G1期还是G2/M期[7]。目前研究大多集中于体外研究，小 碱在体内是否也会产生同样的功效尚未见报道,小 碱的吸收、作用条件都要受机体内环境的限制,有研究报道称小 碱为季铵类化合物，口服不易吸收。因此，小 碱要在体内达到体外实验要求的水平将很难。黄连作为清热解毒中药广泛应用于临床,并且具有很好的疗效,而要将小 碱开发为有效的抗肿瘤药物将有待于进一步研究。

[1] 王秀杰. 黄连的药理研究及现代应用[J]. 中国药师, 2003,6(6): 370.

[2] 张利生. 小 碱临床用途[J] . 中国药物与临床,2004 ,4 (1) :78.

[3] 孟珺,周学琴.紫外分光光度法测定连蒲双清片中盐酸小 碱的含量[J].数理医药学杂志,2004,17(1):51- 57.

[6]W u SN, Yu HS, J an CR, et al. Inhibitory effects of barberine on voltage - and calcium - activated potassium currents in hum an m yelom a cells[J]. Life Sci, 1998, 62 (25): 2283 - 2294

[7] Borg P J, Sitaram B R. Ion- pair extrction and liquid chromatography analysis of morphine in rat brain and plasm a. J Chromatogr Biomed Appl, 1993, 621 (2):165- 168.

Study on extraction process of alkaloids from Rhizoma chinensis and its antitumor activity

(Lanzhou University of Technology, College of life science and engineering, Gansu Lanzhou 730050, China)

Total alkaloids in Coptis chinensis were extracted by alcohol dehydration in this experiment. Extraction process was optimized and the effects of alkaloids on tumor cells and bacteria activity were studied. In the extraction process, the effects of factors on the extraction rate were studied by using ethanol concentration, solid-liquid ratio, extraction time and extraction frequency. Orthogonal experiment was used to optimize the extraction process. Results show ed that the optimum conditions were: ethanol concentration 75%, solid-liquid ratio 1:15, extraction time 1.5h, extraction times 2 times. The inhibition of Hep G2 tumor cells and Escherichia coli, Staphylococcus aureus and Bacillus subtilis were studied by MTT method and antibacterial circle test respectively. The results show ed that alkaloids of Coptis chinensis could inhibit the grow th of Hep G2 tum or cells and bacteria.

Coptis chinensis, alkaloids, antitum or, antibacterial activity