山羊卵泡数量对卵母细胞体外成熟的影响

摘要：分析山羊卵泡数量对卵母细胞体外成熟的影响，根据卵泡数量将卵巢分为3组，探讨卵泡多少对卵母细胞体外成熟的影响。卵泡数目大于14个的设为Ⅰ组，卵泡数目介于8～14个之间的设为Ⅱ组，卵泡数目在1～7个之间的设为Ⅲ组。3组卵巢来源的卵母细胞体外成熟率分别为61.68%、70.26%、63.09%；Ⅱ组的卵母细胞体外成熟率显著高于其他2组。3组之间孤雌激活胚、克隆胚的卵裂率和囊胚发育率无显著差异。来源于卵泡数介于8～14个卵巢的卵母细胞体外成熟率最高，卵巢卵泡数量仅影响卵母细胞的体外成熟率，对发育能力无影响。

关键词：山羊；卵巢；卵母细胞；体外成熟

中图分类号： S827.3文献标志码： A文章编号：1002-1302（2015）09-0232-03

卵母细胞体外成熟是在体外人工设定的条件下，初级卵母细胞经过一系列的生长发育最终形成具有受精能力的MⅡ期成熟卵母细胞的过程。卵母细胞体外成熟可充分利用卵巢丰富的卵母细胞资源用于体外受精、体细胞克隆、转基因动物研究以及发育生物学机理等研究，是现代胚胎生物学研究的重要基础。通过超数排卵等方法获取成熟卵母细胞的成本较高，且资源有限，远远满足不了当前科研、生产的需求。目前主要的解决手段是采集屠宰场卵巢，获取大量未成熟的卵母细胞，通过体外培养成熟，进而应用于科研、生产。山羊卵母细胞体外成熟影响因素较多，主要包括运输温度、卵丘颗粒细胞、卵泡直径、激素、小分子化合物、培养时间等。屈雷等[1]、孙新明等[2]研究认为，卵巢运输温度在25 ℃左右时，卵母细胞成熟率显著高于运输温度接近37 ℃时的成熟率。刘海军等研究表明，卵丘颗粒细胞对卵母细胞体外成熟具有显著影响，卵丘颗粒细胞层数在3层以上的卵母细胞成熟率最好[3]。叶华虎等发现，直径小于1.5 mm卵泡内的卵母细胞仅有个别能完成成熟和卵裂，大于1.5 mm卵泡内的卵母细胞具有核成熟能力，直径大于2.5 mm卵泡内的卵母细胞能较好地支持胚胎继续发育[4]。Kordan等研究表明，促卵泡素和促黄体素联合应用能明显提高山羊卵母细胞成熟率和受精后胚胎的发育率[5]。王艾平等研究表明，表皮生长因子对卵母细胞的体外成熟和卵裂发育具有明显的促进作用[6]。王超等发现，培养24 h或26 h的卵母细胞体外成熟率最好[7]。许杰等研究表明，繁殖季节卵母细胞的成熟率明显高于非繁殖季节[8]。屠宰场采集的山羊卵巢上卵泡数量差异较大，这可能与山羊年龄、生理状态、营养水平等因素有关。卵泡数量是否影响卵母细胞的体外成熟以及后期的胚胎发育尚不清楚，也未见相关研究报道。本试验分析了不同卵泡数量卵巢来源的卵母细胞体外成熟情况、孤雌激活胚发育能力以及克隆胚发育能力，探讨卵泡数量对山羊卵母细胞体外成熟的影响，旨在为山羊体细胞克隆、转基因山羊及其他胚胎工程研究提供参考。

1材料与方法

1.1试剂

本试验所用试剂如无特殊说明均购自Sigma公司。

1.2方法

1.2.1卵巢分组自当地屠宰场采集山羊卵巢，立即放入无菌的生理盐水（含青霉素、硫酸链霉素各100 IU/mL）中，3 h内运至实验室，卵巢到达实验室时的温度为23～28 ℃。将卵巢用28 ℃灭菌生理盐水（含硫酸庆大霉素100 IU/mL）反复冲洗3次，剪去输卵管等附属组织，再用生理盐水反复清洗干净，计算卵巢表面卵泡数量，共统计100个卵巢，确定卵泡数量的最大值、最小值，对最大值与最小值的差值进行等分，最终确定卵泡数量大于14个的卵巢为Ⅰ组，介于8～14个之间的为Ⅱ组，介于1～7个之间的为Ⅲ组。

1.2.2卵母细胞的体外成熟培养将分组的卵巢置于加有捡卵液的平皿中，用手术刀片切割2～6 mm卵泡，使得卵母细胞随卵泡液进入捡卵液，最后在体视显微镜下收集卵丘卵母细胞复合体（cumulus oocytes complexs，COCs）。捡卵液为TCM199（GIBCO）培养液。将挑选的COCs用37 ℃预热2 h的卵母细胞体外成熟液洗3次，转移到含2 mL成熟培养液的培养皿中，在38.5 ℃、5%（体积分数）CO2、最大饱和湿度中培养23 h。卵母细胞体外基础成熟液：TCM199培养液添加 0.22 mg/L 丙酮酸钠、10 μg/mL FSH（宁波第二激素厂）、20 μg/mL LH（宁波第二激素厂）、1 μg/mL 17β-E2、20%胎牛血清（GIBCO），同时添加1%（体积分数）的转铁蛋白-胰岛素-亚硒酸钠（ITS）、10 ng/mL EGF。

1.2.3卵母细胞体外成熟率的统计卵母细胞成熟培养后，将COCs移入3 g/L透明质酸酶溶液中，用移液枪反复吹打卵母细胞，去除外周颗粒细胞，用操作液洗3次，操作液为TCM199添加20%的胎牛血清，最后于显微镜下挑选具有第1极体的卵母细胞，具有极体的细胞与培养细胞的比值即为成熟率。

1.2.4手工克隆胚的构建山羊手工克隆胚的构建参照于鸿浩等的方法[9-10] 进行。利用链酶蛋白酶去除卵母细胞透明带，将其转入操作液中恢复15 min以上，然后将其转移至含有细胞松驰素B的操作液中进行手工去核，去核时利用胚胎切割刀切除靠近极体部位三分之一左右的卵母细胞胞质。收集无核的卵母细胞胞质作为受体，40 d P4～P6代陕北白绒山羊胎儿成纤维细胞为供核细胞。分别转移受体细胞、供体细胞至植物血凝素溶液中，形成2个受体细胞夹杂1个供体细胞的复合体。细胞复合体经电融合后形成克隆胚，再用ionomycin、6-DMAP联合激活。

1.2.5克隆胚的培养将激活的克隆胚胎移入G1胚胎培养液（上海内湖国际贸易有限公司）中进行体外培养。48 h后检查卵裂情况，将形态良好的分裂卵移入G2培养液（上海内湖国际贸易有限公司）中，继续培养至第6天，检查胚胎发育情况。克隆胚培养条件为38.5 ℃、5%（体积分数）CO2、最大饱和湿度。

1.2.6成熟卵母细胞孤雌激活将挑选的成熟卵母细胞转移到含5 μmol/L ionomycin 的TCM199培养液中激活5 min，用操作液洗3次，最后转移到2.5 mmol/L 6-甲基氨基嘌呤培养液中，在38.5 ℃、5%CO2、最大饱和湿度的培养箱中作用4 h，按照克隆胚培养方法进行培养。

1.3数据处理

采用SPSS统计软件进行单因素方差分析。

2结果与分析

2.1不同卵巢来源的卵母细胞体外成熟率

Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ组卵巢来源的卵母细胞体外成熟率分别为6168%、70.26%、63.09%。Ⅱ组卵母细胞体外成熟率显著高于Ⅰ组、Ⅲ组。Ⅰ组、Ⅲ组之间成熟率无显著差异2.3不同卵巢来源的卵母细胞孤雌激活囊胚率

孤雌激活培养至第6天观察囊胚发育情况。Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ组孤雌激活囊胚发育率分别为20.89%、18.19%、21.60%。3组之间差异不显著（表3）。表3不同卵巢来源的卵母细胞孤雌激活囊胚率

2.4克隆胚卵裂率

不同卵巢来源的成熟卵母细胞经手工克隆技术制备成体细胞克隆胚，克隆胚培养48 h，Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ组卵裂率分别为73.37%、72.53%、73.56%。3组之间差异不显著（表4）。表4不同卵巢来源的卵母细胞克隆胚卵裂率

组别 卵裂率 （%）重复1 重复2 重复3 重复4 重复5 平均Ⅰ7572.7370.276583.8773.37±6.94aⅡ66.6770.2773.6878.1373.9172.53±4.30aⅢ67.7481.5878.137070.3773.56±5.95a

2.5克隆胚囊胚发育率

克隆胚培养至第6天观察发育情况，Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ组克隆胚囊胚发育率分别为12.82%、12.06%、10.88%，3组之间差异不显著（表5）。表5不同卵巢来源的卵母细胞克隆胚囊胚发育率

3结论与讨论

哺乳动物卵母细胞成熟过程非常复杂，主要包括卵母细胞核成熟、胞质成熟。卵母细胞核成熟过程主要表现为生发泡破裂、MⅠ期赤道板的形成、同源染色体分离、MⅡ期纺锤体形成、第一极体排出、受精之后第二极体的排出。卵母细胞体外成熟过程中，生发泡破裂代表卵母细胞减数分裂启动，第一极体排出标志着卵母细胞体外成熟，可以受精。与核成熟相比，胞质成熟更为复杂，包括卵母细胞内部各细胞器形态改变和功能建立以及供减数分裂与早期胚胎发育相关的mRNA转录、翻译与修饰，卵母细胞只有核与胞质都充分成熟时才能成功受精，支持胚胎发育[11]。本研究以排出的第一极体为标准判断卵母细胞核是否成熟，结果表明，不同卵巢来源的卵母细胞核体外成熟明显不同，来源于Ⅱ组卵巢的卵母细胞体外成熟培养后第一极体排出率显著高于其他来源的卵母细胞；以孤雌激活胚和体细胞克隆胚的卵裂率、囊胚发育率判断不同卵巢来源的卵母细胞胞质成熟情况，结果表明，不同来源的体外成熟卵母细胞支持孤雌激活胚、体细胞克隆胚发育的能力是相同的。可见，山羊卵泡数量仅影响卵母细胞的核成熟率。卵母细胞成熟发育过程中，激活细胞核功能非常重要[12]。从单层扁平颗粒细胞包围的卵母细胞到早期有腔卵泡阶段的卵母细胞，其核仁是由染色质丝缠绕而形成的网状结构，随着rRNA合成的增加，核仁由RNA合成场所转变为RNA贮存场所[13]。此外，核孔越来越明显，密度增加，核周隙越来越难以分辨。电镜结果显示，生发泡期卵母细胞的核仁由颗粒性纤维成分、空泡及纤维中心组成，染色质高度疏松，有明显的核膜、核仁，核仁正在致密化或已发生致密化。只有核仁完全致密化，核仁周围有染色质相伴分布，卵母细胞才获得恢复减数分裂的能力[13-14]。卵母细胞成熟培养开始后不久，核膜先是有轻微打折，核膜孔消失；与核膜分解行为同步，染色体扩散，显著凝集在核膜内缘；然后发生核膜破裂，直至完全解散，加入内质网池，核内物质与核质混合，此过程即为生发泡破裂[15]。卵母细胞发生生发泡破裂，完成第1次减数分裂后，形成次级卵母细胞进行至第2次减数分裂中期（MⅡ期），并排出第一极体。因此深入研究挖掘卵泡数量对核成熟的影响机制应以细胞核形态、功能变化为切入点。卵巢卵泡数量差异形成可能与动物个体年龄、生理状态、营养水平有关，但由于屠宰场屠宰的动物来源较多、年龄和生理状态等不确定性导致探寻卵巢卵泡数量差异成因较为困难。本研究结果表明，山羊卵巢卵泡数量对山羊卵母细胞体外成熟率具有影响，卵泡数量为8～14个时卵巢来源卵母细胞体外成熟率最高。建议山羊体细胞克隆、转基因动物制备、体外受精等胚胎工程研究选择收集此类卵巢中的卵母细胞作为试验材料。

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