Al3+掺杂的溶胶凝胶分子印迹膜修饰电极测定赭曲霉毒素

贺博，王茜，陈苗苗，文为，张修华，王升富

（湖北大学化学化工学院，湖北 武汉 430062）

0 引言

赭曲霉毒素A（Ochratoxin A，OTA）是曲霉属和青霉属的菌类产生的次生代谢产物，广泛存在于饲料和食品中［1].OTA有强烈的肾毒性和潜在的致癌性，其在食品中含量很低，但是其在动物体内与血浆及组织蛋白结合，不容易通过代谢途径降解，有很长的半衰期（37 d），对人和家畜的健康构成严重危害，引起了国内外的广泛关注［2].欧盟对OTA在谷物和饲料中的最高残留量（MRL）做出了严格的限定（谷物0.5～25 μg·kg-1，饲料5～300 μg·kg-1）［3].在复杂食物样品中，OTA分析检测的选择性和灵敏度要求更高.目前，OTA的常用检测方法主要有免疫亲和柱层析法［4]、高效液相色谱法［5]、电化学免疫法［6]、毛细管电泳法［7]等.上述检测方法虽然准确、灵敏，但样品前处理及操作过程繁琐，费用昂贵，不适宜于现场大量筛选.因此，有必要研制出高效和快速检测OTA的方法.分子印迹聚合物（molecularly imprinted polymers，MIPs）对目标化合物具有高度选择性，在样品的分离、富集、检测领域得到广泛应用［8-13].

在MIPs领域，离子印迹技术被看作是分子印迹技术的一个重要发展方向，它是利用离子和化合物的配位作用促进印迹效率.分子印迹传感器用于离子的检测，已有一些研究，如Ni2+，Cu2+，Cd2+，Zn2+［14-15].迄今为止，在模板分子和官能团的单体之间，金属离子作为螯合剂，在分子印迹传感器的设计方面的研究少有报道.这种金属离子和模板的螯合，相比氢键或静电相互作用，更像是一个共价结合，这使得离子和模板分子以形成相对稳定和高选择性的结合位点.同时，金属离子和模板分子的螯合作用在一定条件下是一种可逆的化学力，因此金属离子和模板分子可以在温和的条件下结合和断裂，能提高模板分子的印迹效率，从而提高传感器的灵敏度和选择性.因此，用金属离子掺杂分子印迹技术来检测OTA具有潜在的应用价值.

本文中采用溶胶凝胶法，以掺杂Al3+离子的硅溶胶为功能单体，赭曲霉毒素A为模板分子制备了OTA印迹的电化学传感器.Al3+的原子轨道可以和模板分子中的羟基配位，并且可以取代硅烷水解后的羟基中的氢，以此提高分子印迹聚合物膜的稳定性和特异性识别能力.采用X线能谱分析（EDX）以及电化学方法对该电极进行表征，对制备分子印迹膜的实验条件进行优化，并在潜在干扰物存在的条件下对“印迹电极-OTA”的选择性进行研究.

1 实验

1.1 试剂和材料四乙氧基硅烷（TEOS）购于阿拉丁试剂有限公司（中国上海）.乙二醇二缩水甘油醚（EGDE）购于上海如发化工科技有限公司，HCl购于东大化工有限公司试剂厂（中国开封）.AlCl3·6H2O购于国药集团化学试剂有限公司.赭曲霉毒素（OTA）购自Sigma-Aldrich公司（美国）.所有化学试剂均为分析纯，实验用水为超纯水.

1.2 实验仪器电化学工作站（辰华有限公司CHI660C，中国上海）；测试采用常规的三电极体系：玻碳电极（GCE：Φ=3mm）及其修饰电极作为工作电极，饱和甘汞电极作为参比电极和铂丝电极作为辅助电极；德国电化学工作站（ZAHNER IM6，德国）用于印迹膜的洗脱和培养过程研究；X线能谱分析（EDX，JEOL JSM7100F）用于印迹膜的元素能谱分析.紫外-可见光谱（UV-3600，日本岛津）用于Al3+和模板分子相互作用的研究.

1.3 印迹传感器的制备玻碳电极GCE抛光后依次用超纯水、乙醇和超纯水超声波清洗.制备印迹传感器的过程如图1所示：首先，将TEOS（1.0mL）、EGDE（2.7mL）、1.35mmol/L AlCl3溶液（0.1mol/LHCl中用作溶剂）和2.0mL超纯水混合并搅拌，得到均相原溶胶，形成功能性单体和Al3+金属配合物.将该溶液与0.45 mmol/L的OTA混合搅拌12 h得到的Al3+/OTA溶胶-凝胶金属离子络合的复合物.将处理干净的GCE浸在制备好的印迹溶胶中，采用CV在-0.2～1.0 V电位扫描区间以50 mV·s-1扫描速率进行电沉积20圈，制备Al3+/OTA-MIP-GCE.制得OTA印迹的Al3+溶胶凝胶分子印迹聚合物修饰电极（Al3+/OTA-MIP-GCE），在室温下干燥过夜，然后在乙醇和乙酸（8∶2，体积比）洗脱，移走模板分子OTA后得到印迹聚合物修饰电极（Al3+-MIPGCE）.相同实验条件下，未加入模板分子，制得非印迹修饰电极（Al3+-NIP-GCE）.

图1 分子印迹电化学传感器的制备

2 结果与讨论

2.1 Al3+-MIP-GCE的结构探讨印迹电极的洗脱和重新印迹过程中，分子印迹膜与模板分子间相互作用的设计印迹电极的响应效果至关重要.在OTA分子中，具有苯环、氨基以及多个羟基，其中氧原子和氮原子可以与SiO2网络中的羟基形成氢键.将Al3+掺杂到SiO2网络中，一方面Al3+的原子轨道可以与模板分子中羟基及苯环配位，使模板分子更好地嵌入到聚合物膜中，另一方面可以嵌入到硅烷水解后的硅氧键中，增多了功能单体与模板分子的结合点，增强分子印迹聚合物膜的稳定性和特异性识别能力.其相互作用的可能结构如图1所示.

X线能谱分析用于膜的元素分析.图2所示分别为印迹膜洗脱前（A）和洗脱后（B）的元素分析图谱，对比A图与B图可以看到，由于Al元素嵌入到硅烷水解后的硅氧键中，因此，洗脱前后Al元素变化不大，而Cl元素被洗脱掉，导致洗脱后有明显的降低.

图2 Al3+-MIP-GCE洗脱前（a）和洗脱后（b）的元素能谱图

2.2 Al3+-MIP-GCE电化学表征采用电化学阻抗谱（EIS）和循环伏安CV对Al3+-MIP-GCE进行了表征.在含有0.5mol/LKNO3的0.5mmol/L［Fe（CN）6]3-/4-中，裸电极的电化学阻抗谱几乎是一条直线（图3 A，曲线a），表明电子传递过程是一个质量控制的过程.然而，分子印迹修饰电极（Al3+/OTA-MIP-GCE）呈现出较大的阻抗，这是由于一层致密的膜覆盖在电极的表面，阻碍了氧化还原探针的电子转移（图3 A，曲线b）.当除去模板分子后，Al3+-MIP-GCE阻抗急剧下降，表明印迹膜腔已经形成（图3A，曲线c），形成的空穴有利于电子传递；当Al3+-MIP-GCE在0.124μmol/LOTA标准溶液中培养后，阻抗在一定程度有所增大，这是由于模板分子和印迹膜空穴之间的相互作用，模板分子重新填充了印迹膜腔，进而又阻碍了探针分子的电子转移（图3A，曲线d）.这些结果与CV表征是一致的（图3B）.

图3 不同电极的阻抗谱图（A）和循环伏安图（B）

2.3 分子印迹溶胶-凝胶聚合物的优化

2.3.1 Al3+离子对印迹电极的影响及Al3+量的优化 采用［Fe（CN）6]3-/4-为电化学探针，进行DPV测定，进一步印迹电极的特性，如图4所示，A图中b和a曲线分别是Al3+-MIP-GCE在OTA的溶液中培养之前和之后的DPV；B图中b和a曲线分别是MIP-GCE在OTA的溶液中培养之前和之后的DPV.由图4可以观察到图A中曲线a与b的DPV峰电流差值明显比B图中的大，这可能是因为掺杂的Al3+与模板分子有配位作用，从而提高分子印迹膜的选择性.

图4 不同电极的差分脉冲图（A）和（B）分别为Al3+-MIP-GCE和MIP-GCE

由于金属配位剂可以饱和，所以实验对Al3+的量进行了优化.图5所示为OTA的紫外可见吸收曲线，在330 nm处出现明显的紫外吸收峰.当Al3+逐渐加入到OTA溶液后，330 nm处的紫外吸收峰的逐渐降低，370 nm处出现吸收峰并逐渐增强.由此推断，OTA和Al3+存在一定的相互作用.将两处吸收峰的峰值与OTA和Al3+的比值作图，得到当OTA与Al3+的比值为2时两处吸收峰均趋于稳定.

2.3.2 洗脱和培养时间的影响 将Al3+-MIP-GCE浸没在乙醇/醋酸（体积比为8∶2）进行洗脱，由图6（a）可知，峰电流随着洗脱时间的增加而增加，当洗脱25min后，电流趋于稳定，此时，表明印迹膜表面达到洗脱吸附平衡.将洗脱除去模板分子的Al3+-MIP-GCE在OTA溶液中培养，峰电流随着培养时间的增加呈下降趋势，在25min后得到一个稳定的电流响应，表明达到吸附平衡.因此，后续研究选择25min作为最佳洗脱和培养时间.

图5 AlCl3溶液中加入毒素后的紫外吸收光谱

图6 洗脱时间（a）和培养时间（b）的优化

2.4 线性范围与检出限在最佳条件下，Al3+-MIP-GCE电极在不同浓度OTA标准溶液培养，于［Fe（CN）6]3-/4-中测试，结果如图7所示.由图可知，随着OTA浓度逐渐增大，［Fe（CN）6]3-/4-的峰电流逐渐减小.图7插图为OTA浓度和［Fe（CN）6]3-/4-峰电流之间的工作曲线.实验结果表明：OTA在1.24×10-8～1.24×10-6mol/L范围内与峰电流呈良好的线性关系，其相关系数为0.996，检出限为3.76×10-9mol/L.而对于Al3+-NIP-GCE，由于缺乏特异性结合位点，电流和OTA浓度不成线性关系并且迅速达到吸附饱和.

图7 传感器与不同浓度毒素培养后在1mmol/L［Fe（CN）6]3-/4-的差分脉冲及线性关系图

2.5 印迹传感器的重现性和稳定性对Al3+-MIP-GCE传感器的重现性和稳定性进行了研究，测定同一印迹电极对0.124μmol/LOTA的响应值，3次测量的相对标准偏差为4.3%；采用3支不同的修饰电极在0.124μmol/L OTA的培养液中培养后测定，其相对标准偏差为5.7%，表明印迹电极具有较好的重复性.印迹电极使用后置于冰箱中保存，连续印迹和洗脱10次，其响应信号几乎没有改变.结果表明，该传感器具有良好的重现性和稳定性.

3 结论

以掺杂Al3+离子作为改性剂制备了分子印迹聚合物修饰的电化学传感器.Al3+与模板分子强的配位作用提高了掺杂分子印迹聚合物的印迹效率.该传感重现性和稳定性好，具有潜在的应用前景.

［1]Kabak B，Dobson A，Var I.Strategies to preventmycotoxin contamination of food and animal feed.a review［J].Crit Rev Food Sci，2006，46（8）：593-619.

［2]高翔，李梅，张立实.赭曲霉毒素A的毒性研究进展［J].国外医学：卫生学分册，2005，32（1）：5l-55.

［3]杨家岭，岳田利，高振鹏.赭曲霉毒素A检测方法的研究进展［J].农产品加工·学刊，2008，6（1）：1671-9646-B.

［4]Krogh P.Roleofochratoxm in disease causation［J].Food Chem，1992，30：213-224.

［5]谢妮，徐强，吕相征，等.高效液相色谱法检小麦、大米中赭曲霉毒素A［J].中国公共卫生，2003，19（2）：1001-0580.

［6]Breyer B，Radcliff F J.Polarographic investigation of the antigen-antibody reaction［J].Nature，1951，167（4237）：79-79.

［7]曾红燕，黎源倩，晋军，等.毛细管电泳法测定玉米赤霉烯酮及其代谢物［J].四川大学学报：医学版，2003，34（2）：333-336.

［8]杨亚军，李剑勇.分子印迹技术及其在药物分析和残留检测中的应用［J].畜牧与兽医，2009，41（4）：101-104.

［9]赖佳平，何锡文，郭洪声，等.分子印迹技术的回顾现状与展望［J].分析化学研究报告，2001，29（7）：836-844.

［10]Zhou H J，Zhang Z J，He DY，etal.Molecular imprinting polymer coated BAW bio-mimic sensor for directdeter mination of epinephrine［J].AnalChim Acta，2004，523（2）：237-242.

［11]Hu Y I，Li J，Hu Y F，et al.Development of selective and chemically stable coating for stir bar sorptive extraction by molecularly imprinted technique［J].Talanta，2010，82（2）：464-470.

［12]Abbate V，Bassindale A R，Brandstadt K F，et al.Biomimetic catalysis at silicon centre using molecularly imprinted polymers［J].JCatal，2011，284（1）：68-76.

［13]Sontimuang C，Suedee R，Dickert F.Interdigitated capacitive biosensor based on molecularly imprinted polymer for rapid detection ofHev b1 latex allergen［J].Anal Biochem，2011，410（2）：224-233.

［14]Ozkutuk EB，Karabork M.Fe3+-imprinted polymeric systems［J].Hacettepe J Biol&Chem，2007，35（3）：195-202.

［15]Dhal PK，Arnold FH.Metal-coordination interactions in the template-mediated synthesis of substrate-selective polymers：recognition of bis（imidazole）substrates by Cu2+iminodiacetate containing polymers［J].Macromolecules，1992，25（25）：7051-7059.