血清miRNA-124 miRNA-221在缺血性脑卒中的临床应用

周晓冬 郝瑞 肖小平

血清miRNA-124 miRNA-221在缺血性脑卒中的临床应用

周晓冬 郝瑞 肖小平

目的 探讨血清miRNA-124、miRNA-221在缺血性脑卒中患者中的临床应用价值。方法 收集缺血性脑卒中患者85例的临床资料，将脑卒中患者分为完全卒中组和进展卒中组，选取同期本院健康体检者38例为对照组。采用实时荧光定量PCR（RT-PCR）技术检测血清miRNA-124、miRNA-221的表达。结果 脑卒中患者血清miRNA-124、miRNA-221表达与对照组比较分别上调和下调，差异有统计学意义（P＜0.01）；miRNA-124在进展卒中组的表达水平低于完全卒中组（t=21.37，P＜0.01），miRNA-221的表达水平则高于完全卒中组（t=22.26，P＜0.01）。完全卒中组和进展卒中组miRNA-124、miRNA-221表达均呈负相关（r=-0.687，-0.692，P＜0.01）。两组患者中miRNA-124，miRNA-221的表达水平分别和甘油三酯、总胆固醇、收缩压及空腹血糖具有相关性［（r=0.387，0.316，0.369，0.337，P＜0.01）；（r=0.-328，-0.368，-0.329，-0.382，P＜0.01）］。结论 检测血清miRNA-124、miRNA-221表达可预测缺血性脑卒中疾病的发生及判断其危险程度，估计病情的发展状况。

缺血性脑卒中 miRNA-124 miRNA-221 完全性卒中 进展性卒中

缺血性脑卒中的发病率约占脑卒中总数的60%～70%，其原因可能是由于颈内动脉和椎动脉狭窄和闭塞引起，动脉粥样硬化是狭窄和闭塞的主要原因［1］。尽早恢复缺血脑组织的灌注及减轻脑组织的损伤，成为治疗急性缺血性脑卒中的首要目标［2］。miRNA 广泛参与缺血性脑卒中的发生、发展过程，如动脉粥样硬化、脑水肿、缺血再灌注损伤等方面［3］。本文采用实时荧光定量PCR（RT-PCR）技术检测缺血性脑卒中患者的血清miRNA-124、miRNA-221表达，探讨缺血性脑卒中的发病机制。

1　临床资料

1.1一般资料 选取2014年1至10月本院收治的缺血性脑卒中患者85例；既往有高血压病63例、糖尿病27例、冠心病16 例、长期大量吸烟 32 例。SSS评分（30.7±7.9）分。所有患者均符合全国第四届脑血管病学术会议修订的诊断标准。患者发病时间＜24h，均为首次发病，并经头部CT或MRI检查确诊。排除心源性因素引起的卒中。依据病情分为完全卒中组和进展卒中组。完全卒中组43例，男27例，女16例；年龄47～80岁，平均年龄（61.5±11.3）岁。进展卒中组42例，男25例，女17例；年龄45～78岁，平均年龄（63.2±12.3）岁。选取同期本院健康体检者38例为对照组，男24例，女14例；年龄45～79岁，平均年龄（60.2±10.7）岁。各组的性别和年龄比较差异无统计学意义（P＞0.05）。本项目经本院伦理委员会批准。

1.2方法 （1）所有患者在发病后6h分别采集静脉血，在＜2h作如下处理：4℃1500r/min离心10min，取上清液，4℃1500r/min，进一步离心10min，将所得的血清标本分装于无RNA酶和DNA酶的冻存管中，-80℃保存。采用RT-PCR检测血清中miRNA-124、miRNA-221的表达。（2）仪器、试剂和引物：采用mirVANA PARIS试剂盒提取总RNA。在冰上融化血浆，吸取100ml，加入等体积的变性液，涡旋混匀，在冰上孵育5min；再加入等体积的酸/酚/氯仿，涡旋混匀1min，冷冻离心5min，重复此步骤3次，再与1.25倍体积的无水乙醇充分混合，过柱，洗柱2次，将所得的RNA用缓冲液稀释；再加葡萄糖和无水乙醇在-80℃沉淀，弃去上清液，将沉淀物在空气中干燥2～3min，用无RNA酶水1μl溶解，相当于100μl的血浆。每个样品取3μl逆转录，PCR反应体系如下：10μl 2×Taqman通用的PCR预混物，1μl 20×miRNA特异性引物，1.33μl cDNA，7.67μl水；95℃变性10min，95℃15s，60℃1min，50循环（每个样品重复3次）。miRNA-124、miRNA-221表达量用Ct值变化表示。△Ct（HVCT）均值-（Xn）Ct，（HVCT）是所有健康志愿者Ct的平均值，Xn表示每个受试对象的Ct值。缺血性脑卒中与健康对照样本相应的miRNA的相对表达量为2-△ct。

1.3统计学方法 采用SPSS18.0软件。计量资料用（x±s）表示，用t检验，相关性分析用Pearson 法。以P＜0.05为差异有统计学意义。

2　结果

2.1各组脑血管危险因素结果比较 完全卒中和进展卒中组的甘油三酯（TG）、总胆固醇（TC）、收缩压（SP）及空腹血糖（FBG）分别与对照组比较均增高，其差异均有统计学意义［（t=12.33，17.61，11.73，9.21，P＜0.01）；（t=11.42，10.49，8.59，9.15，P＜0.01）］；两卒中组的甘油三酯、总胆固醇水平比较差异均有统计学意义（t=5.62，3.23，P＜0.01）。见表1。

表1　各组部分心血管危险因素结果比较（x±s）

2.2卒中组miRNA-124、miRNA-221表达水平比较 完全卒中组和进展卒中组miRNA-124表达量分别与对照组比较明显上调，差异有统计学意义（t=36.55，13.87，P＜0.01）；完全卒中组和进展卒中组miRNA-221与对照组比较明显下调，差异有统计学意义（t=39.65，14.55，P＜0.01）； miRNA-124在进展卒中组的表达量低于完全卒中组（t=21.37，P＜0.01），miRNA-221在进展卒中组的表达量则高于完全卒中组（t=22.26，P＜0.01）。见表2。

表2　各组miRNA-124、miRNA-221水平比较（x±s）

2.3相关性分析 完全卒中组和进展卒中组miRNA-124、miRNA-221表达均呈负相关（r=-0.687，-0.692，P＜0.01），miRNA-124、miRNA-221的表达水平分别和甘油三酯、总胆固醇、收缩压及空腹血糖具有相关性（r=0.387，0.316，0.369，0.337，P＜0.01）；（r=0.-328，-0.368，-0.329，-0.382，P＜0.01）。

3　讨论

缺血性脑卒中的发生主要是由于颅内动脉粥样硬化血栓形成导致血管闭塞或斑块破裂而引起血管栓塞［1］。研究证明血清中存在着稳定的miRNA［4，5］，有报道认为，miRNA-124在脑缺血24h后的大鼠血浆中表达明显增高［6］，Weng等［7］研究认为，miRNA-124 参与神经元分化、神经生长发育以及脑组织损伤后的调控，建立大鼠大脑中动脉阻塞模型，检测其血浆miRNA-124水平，结果发现在脑缺血6h miRNA-124即开始升高，一直持续＞48h。通过检测其表达协助诊断脑卒中的发生并有可能评估该疾病预后。本资料通过RT-PCR技术检测缺血性脑卒中患者血清miRNA-124的基因表达，结果显示两卒中组miRNA-124表达较对照组均上调，提示缺血性脑卒中疾病的进展受到miRNA-124表达的影响。完全卒中组miRNA-124水平较进展卒中组上调更明显，表明进展性脑卒中患者脑血管内可能存在血栓形成，完全性卒中组患者可能出现脑血管栓塞。提示miRNA-124可以作为缺血性脑卒中早期诊断评价的有效补充。

动脉粥样硬化是缺血性脑卒中最主要的危险因素，血管内斑块形成是动脉粥样硬化的标志，内皮细胞损伤，脂质沉积等是斑块形成的主要过程［3］。Albinsson等［8］研究认为，在动脉粥样硬化患者中存在miR-221，miR-222，miR-126，miR-130a等调节失控，而这些miRNA由血管内皮细胞产生。Tsai等［9］对人群小样本脑血管病研究发现，外周血清的miRNA-221表达水平显著低于健康对照组，因此miRNA-221可以作为脑血管疾病的潜在标志物。本资料结果也显示，两卒中组miRNA-221表达低于对照组，完全卒中组水平下调更明显，提示缺血性脑卒中患者脑血管存在一定的损伤，完全卒中组患者较进展卒中组损伤更严重，表明进展性卒中患者脑血管内可能存在斑块形成，从而加大了卒中发生的风险，完全卒中患者可能出现脑血管栓塞。因此，通过对miRNA-221的检测，可作为缺血性脑卒中疾病的早期发现和预后评价。

本资料结果显示在缺血性脑卒中疾病两病例组中血清miRNA-124和miRNA-221表达水平具有负相关性，其分别与甘油三酯、总胆固醇、收缩压及空腹血糖也有相关性，提示两标志物参与了缺血性脑卒中疾病的病理发展，与该疾病的发生和发展密切相关。因此，联合检测血清miRNA-124和miRNA-221水平可预测缺血性脑卒中的发生，判断其危险程度，评估病情的发展状况。

1 陈孝平，汪建平.外科学.第八版.北京：人民卫生出版社，2013. 285～286.

2 刘竞丽，秦超.缺血性脑卒中血液生物标志物的检测及临床应用.中华检验医学杂志，2014，37（7）：497～500.

3 保玉莲，朱榆红.MicroRNA与缺血性脑卒中关系的研究进展.中国实用神经疾病杂志， 2014，17（4）：94～97.

4 Brase JC，Wuttig D，Kuner R，et al.Serum microRNAs as noninvasive biomarkers for cancer.Mol Cancer，2010，9：306.

5 Arroyo JD，Chevillet JR，Kroh EM .et al.Argonaute complexes carry a population of circulating microRNAs independent of vesicles in human plasma .Proc Natl Acad Sci USA，2011，108（12）：5003～5008.

6 林洋，芮耀诚.脑缺血大鼠脑组织及血浆中microRNA-124a表达的变化.中国脑血管病杂志，2011，8（3）：143～147.

7 Weng HC，Shen，GouHirokawa，et al.Plasma miRNA-124 as a biomarker for cerebral infraction.Biol Res，2011， 32（2）： 135～141.

8 Albinsson S，Sessa WC.Can microRNAs control vabcular smooth muscle phenotypic modulation and the response to injury.Physiol Genomicomplete stroke， 2011，43（10）：529～533.

9 Tsai YC，Wang YS，et al.Serum microRNA-21 and microRN-221as potential biomarkers for cerebrovascular disease.J Vasc Res，2013，50（4），346～354.

710061 陕西省西安市第八医院检验科（周晓冬 肖小平）712000陕西省咸阳市第一人民医院康复科（郝瑞）