骨髓间充质干细胞缺血培养上清细胞因子分析

滕小梅　Md Abdur Rob Rayhan 刘廷兴　沈振亚★

·实验研究·

骨髓间充质干细胞缺血培养上清细胞因子分析

滕小梅Md Abdur Rob Rayhan 刘廷兴沈振亚★

目的 研究骨髓间充质干细胞在缺血条件下分泌的细胞因子浓度变化。方法 用全骨髓差异贴壁法分离培养骨髓间充质干细胞（BMSCs），取第3代细胞进行实验。实验分两组：A组提取正常培养细胞的上清液；B组将细胞置于无血清的培养基中24h后，提取上清液。采用蛋白分析技术检测细胞培养上清液中27种细胞因子变化情况。结果 无血清细胞培养组中ICAM-1、IFN-γ和IL-10的浓度与有血清的细胞培养组比较差异有统计学意义（P＜0.05）。结论 骨髓间充质干细胞在缺血条件下分泌的炎症相关细胞因子发生变化。

骨髓间充质干细胞 缺血培养 细胞因子

骨髓间充质干细胞（Bone marrow-derived mesenchymal stem cells，BMSCs）改善心功能的研究已成为国际研究热点，但细胞移植改善心脏功能的机制仍存在许多争议，目前主要认为干细胞的旁分泌机制发挥主要作用，即骨髓间充质干细胞分泌大量细胞因子抑制细胞凋亡，促使心脏毛细血管生长，改善衰竭心肌血供，抑制炎症反应，减轻心肌损伤。作者自2014年1月至7月分别应用有血清和无血清培养基培养MSC，研究其分泌的细胞因子差异，探讨骨髓间充质干细胞在急性缺血环境下的旁分泌作用。

1　材料和方法

1.1材料 健康8周龄清洁级SD大鼠10只，均从中国科学院实验动物中心购买，之后均按照GLP于苏州大学心血管病研究所实验室动物房进行喂养和观察。低糖DMEM培养基（Hyclone）、胎牛血清（Gibco）、QAR-CYT-3芯片（Raybiotech）。

1.2骨髓间充质干细胞（BMSCs）的培养及鉴定 通过全骨髓培养方法，当细胞培养至第三代时，流式细胞仪鉴定细胞表面分子CD29、CD90、CD73、CD11b的表达。

1.3MSC培养上清液中细胞因子分析 A组：收集第三代MSC在10%FBS的培养基的上清液，B组：收集第三代MSC在无血清培养基中24h后上清液，应用蛋白分析芯片QAR-CYT-3，按照Raybiotech公司的标准操作流程进行，检测27种大鼠细胞因子：B7-2、b-NGF、CINC-1、CINC-2、CINC-3、CNTF、Fractalkine、GM-CSF、ICAM-1、IFN-γ、IL-1a、IL-1b、IL-2、IL-4、IL-6、IL-10、IL-13、LIX、L-Selectin、MCP-1、PDGF-AA、Prolactin R、RAGE、TCK-1、TIMP-1、TNFα、VEGF。芯片结果采用GenePix4000B进行扫描，用软件GenePix Pro 6.0读取原始数据，使用标准分析软件对数据进行处理，计算各样品的浓度。

1.4统计学方法 统计采用SPSS17.0统计软件分析。数据以表示，两组间均数的比较采用t检验，以P＜0.05为差异有统计学意义。

2　结果

2.1骨髓间充质干细胞的培养及鉴定 P0代细胞在1～2d即开始有少量细胞贴壁，细胞形态不规则，多数呈现纺锤状、多角形。P1代以后细胞生长迅速，2h后开始贴壁，细胞以集落生长的形式为主。细胞整体排列呈漩涡状、辐射状或鱼群样排列。取P3进行实验，根据流式细胞仪检测结果，显示BMSCs超过90%表达CD29及CD90，但不表达造血干细胞表面标志CD34及CD4。

2.2MSC条件培养液中细胞因子的检测 采用蛋白分析芯片法测定MSC在有血清和无血清条件培养下分泌的细胞因子，结果显示无血清细胞培养组中ICAM-1、IFN-γ和IL-10的浓度与有血清的细胞培养组比较差异有统计学意义（P＜0.05）。见表1，其它细胞因子浓度差异无统计学意义。

表1　两组培养上清液中细胞因子的浓度［只，（x±s）］

3　讨论

目前认为MSC主要通过分泌相关细胞因子在修复受损心肌中发挥旁分泌作用。MSC能够分泌多种细胞因子，包括炎症、造血、神经发育和血管再生等相关的细胞因子。MSC可分泌IL-6、IL-12、粒细胞集落刺激因子和干细胞因子［1，2］。MSC还能够分泌脑源性神经营养因子和血管内皮生长因子［3］，分泌胶质源性神经营养因子和神经生长因子。而缺氧预处理可提高MSC的生存能力，缺氧损伤能够激活多种细胞因子如血管内皮生长因子（VEGF）和间质源因子（SDF-1）等的分泌［4］。大量实验证实体外缺氧缺血预处理骨髓间充质干细胞能更有效改善心功能。机制可能是骨髓间充质干细胞在缺血环境下通过分泌一些细胞发挥重要作用。本实验将骨髓间充质干细胞置于无血清培养的体系中，分析其分泌的细胞因子变化，结果显示：上清液中 ICAM-1、IFN-γ以及IL-10的浓度明显降低。

ICAM-1属于黏附分子中免疫球蛋白超家族（IGSF）中的成员，ICAM-1 在静息的血管内皮细胞上呈低水平表达，通过与血管内皮细胞表面上的特异性受体结合而发挥其生物学活性［5、6］。IFN-γ可增强自然杀伤细胞（NK细胞）、巨噬细胞和T淋巴细胞的活力，从而起到免疫调节作用，并增强抗病毒能力。IL-10是由单核巨噬细胞、T细胞、B细胞等多种细胞产生和具有多向性生物活性的强的免疫抑制因子，改变机体的免疫应答和MHCⅡ类抗原的表达，并介导Th1和Th2两类T细胞之间的相互调节。IL-10抑制Th1介导的DTH反应，对临床的器官移植、抗炎症、抗寄生虫病和某些传染病的治疗将有潜在应用前景。

1 Rafii S， Meeus S， Dias K， et al. Contribution of marrow-derived progenitors to vascular and cardiac regeneration. Semin Cell Dev Biol. 2002：13（1）：61～67.

2 Haynesworth SE，Baber MA，CaplanAI. Cytokine expression by human marrow-derived mesenchymal progenitor cells in vitro：effects of dexamethasone and IL-1 alpha. J Cell Physiol. 1996：166（3）：585～592.

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5 宋宜慧，黄熙.细胞间黏附分子-1与血管生成的研究进展.免疫学杂志，2012，23（6）：530～533.

6 Sarecka HujarB， Zak I， Krauze J. Interactions between rs5498 polymorphismin the ICAM1 gene and traditional risk factors influence susceptibility to coronary artery disease.Clin ExpMed， 2009， 9（2）： 117～124.

Objective To study the secreted cytokine concentration changes of bone marrow mesenchymal stem cells（BMSCs）in ischemic conditions. Methods Bone marrow mesenchymal stem cells were cultured by adherent culture of whole bone marrow.The third generation of cells were used in this study. The experiments were divided into two groups：A. The supernatant wwas collected from normal cell culture. B. The supernatant was from cells in serum-free medium 24h. 27 kinds of cytokines in the supernatant were analyzed through the protein assay. Results Compared with the normal culture condition group，the concentration of ICAM-1，IFN- γ and IL-10 in the serum-free culture group were signifi cant decreased.（P＜0.05）. Conclusion There were changes in the infl ammation related cytokines secreted by bone marrow mesenchymal stem cells in the ischemic condition.

Bone marrow mesenchymal stem cells Ischemic conditions cytokines

苏州市科技计划项目资助（SYS201327）

215006 苏州大学附属第一医院