RP-HPLC法同时测定线纹香茶菜不同生长部位中三萜酸成分

邹盛勤， 姜 琼（江西省天然药物活性成分研究重点实验室，宜春学院化学与生物工程学院，江西　宜春　336000）

RP-HPLC法同时测定线纹香茶菜不同生长部位中三萜酸成分

邹盛勤， 姜 琼*
（江西省天然药物活性成分研究重点实验室，宜春学院化学与生物工程学院，江西宜春336000）

目的 建立反相高效液相色谱法（RP-HPLC）同时测定线纹香茶菜全草、根、茎和叶中坡模酸、山楂酸、科罗索酸、齐墩果酸和熊果酸5种三萜酸的含有量。方法 线纹香茶菜95%乙醇提取液的分析在Kromasil C18色谱柱（4.6 mm×250 mm，5μm）上进行，流动相为甲醇-2.0%乙酸水溶液（88∶12，V/V），体积流量1.0 mL/min，检测波长210 nm，柱温25℃。结果 坡模酸、山楂酸、科罗索酸、齐墩果酸和熊果酸进样量分别在0.552～41.4 mg/L（r =0.999 5），0.540～40.5 mg/L（r=0.999 6），0.824～61.8 mg/L（r=0.999 9），2.444～183.3 mg/L（r=0.999 7）和3.172～237.9 mg/L（r=0.999 7）范围内线性关系良好，加样回收率分别为98.1%、98.0%、96.3%、99.7%、99.0%。RSD（n=6）均小于2.2%。结论 线纹香茶菜样品不同部位中，5种三萜酸类成分含有量高低依次为叶＞全草＞茎＞根。

线纹香茶菜；三萜酸；坡模酸；山楂酸；科罗索酸；齐墩果酸；熊果酸

线纹香茶菜为唇形科Lamiaceae香茶菜属Rabdosia植物线纹香茶菜Rabdosia lophanthoides（Buch.-Ham.ex D.Don）Hara的全草，俗称溪黄草、熊胆草、血风草、黄汁草、溪沟草、香茶菜、土黄连等［1-3］。线纹香茶菜因其喜生于山谷明湿溪旁，新鲜叶片揉碎有黄汁而得名，主产于长江以南的湖南、四川、云南、江西、广东、广西等省区，其味辛、性温，具有清热利湿、凉血散瘀和驱虫的功效，用于治疗湿热泻痢，跌打瘀肿，急性黄疸型肝炎，急性胆囊炎，痢疾、肠炎、跌打瘀痛等病症［4-5］。线纹香茶菜含萜类、黄酮类、酚类、氨基酸等多种化学成分［6-8］。王兆全［9］等从线纹香茶菜的干叶乙醇提取物中分离出β-谷甾醇、齐墩果酸、2α，19α-二羟基乌苏酸、β-谷甾醇-D-葡萄糖苷及线纹香茶菜酸等5种单体，有关线纹香茶菜单个三萜类成分如熊果酸、2α-羟基熊果酸的测定已有报道［10-11］。但采用反相高效液相色谱法同时测定线纹香茶菜不同部位中多种三萜酸的量尚未见文献报道。本实验以广东省连州线纹香茶菜为实验材料，优化色谱条件，对其所含坡模酸、山楂酸、科罗索酸、齐墩果酸和熊果酸等5个三萜酸类成分进行了分离和定量测定，可作为线纹香茶菜的质量控制和药效基础物质研究的依据。

1　仪器与试剂

1.1仪器 高效液相色谱仪，包括双515泵，2996光电二极管阵列检测器，Empower中文色谱数据工作站（美国Waters公司）；SK2510HP超声波清洗器（上海科导超声仪器有限公司，功率250 W，频率59kHz）CP225D电子分析天平（德国Sartourius公司）。

1.2试药 甲醇（色谱纯，德国MERCK公司），其余试剂均为分析纯，水为重蒸水。坡模酸对照品（上海如吉生物科技发展有限公司，批号120528）；山楂酸和科罗索酸对照品（上海源叶生物科技有限公司，批号分别为20110105、20120502）；齐墩果酸、熊果酸对照品（中国药品生物制品检定院，批号分别为110709-200304、110742-200314）。线纹香茶菜原料药采自广东省连州市，经鉴定为唇形科香茶菜属植物线纹香茶菜Rabdosia lophanthoides（Buch.-Ham.ex D.Don）Hara的全草。

2　方法与结果

2.1溶液配制

2.1.1对照品溶液 分别精密称定坡模酸2.76 mg、山楂酸2.70 mg、科罗索酸4.12 mg、齐墩果酸12.22 mg、熊果酸15.86 mg对照品，置于50 mL量瓶中，加适量甲醇超声溶解并稀释至刻度，摇匀，制成含坡模酸0.055 2 mg/mL、山楂酸0.054 0 mg/mL、科罗索酸0.082 4 mg/mL、齐墩果酸0.244 4 mg/mL和熊果酸0.317 2 mg/mL的混合对照品贮备液。

2.1.2样品溶液 线纹香茶菜样品按部位分离后置恒温干燥箱中于70℃下干燥4 h，高速粉碎机粉碎后过40目筛。精密称取线纹香茶菜各样品粉末约1.0g，分别置于50 mL具塞锥形瓶中，加入95%乙醇50 mL，称定质量。超声提取45 min，冷却后用95%乙醇补足损失质量，摇匀，用0.45μm滤膜过滤，取续滤液作为样品溶液。

2.2色谱条件 Kromasil C18色谱柱（4.6 mm× 250 mm，5μm）；流动相为甲醇-2.0%乙酸水溶液（88∶12，V/V），体积流量1.0 mL/min；检测波长210 nm；柱温为25℃；运行压力为1 365 psi（1 psi=6.894 kPa）。对照品溶液中坡模酸、山楂酸、科罗索酸、齐墩果酸和熊果酸分离度分别为2.29、3.08、2.33、14.15和1.88，对称因子分别为1.03、1.01、1.00、1.01和1.01，外标法定量分析。对照品和线纹香茶菜样品色谱见图1。

图1　对照品溶液（A）和线纹香茶菜样品溶液（B）HPLC色谱Fig.1 HPLC chromatograms of reference substances（A）and sample（B）

2.3精密度试验 分别精密吸取同一质量浓度坡模酸、山楂酸、科罗索酸、齐墩果酸和熊果酸对照品溶液20μL，连续进样5次，以峰面积计算色谱系统精密度，坡模酸、山楂酸、科罗索酸、齐墩果酸和熊果酸峰面积RSD（n=5）分别为1.4%、1.0%、1.5%、1.4%和1.3%，表明仪器精密度良好。

2.4线性关系试验 分别吸取坡模酸、山楂酸、科罗索酸、齐墩果酸和熊果酸对照品混合贮备液0.2、0.5、1、5、10、15 mL置20 mL量瓶中，加甲醇至刻度，摇匀，得混合对照品系列溶液。分别吸取对照品混合系列溶液20μL进样分析，按色谱条件测定峰面积，以对照品的进样量为横坐标，峰面积为纵坐标，绘制线性标准曲线。5种三萜酸组分的线性方程、线性范围和线性相关系数见表1。

表1　三萜酸的线性关系Tab.1 Linear relations of five triterpenic acids

2.5重复性试验 取线纹香茶菜同一样品（全草）6份，每份各约1.0 g，按“2.1.2”项下方法制备样品溶液。精密吸取各样品溶液20μL，注入液相色谱仪，测定5个组分峰面积积分值，外标法计算坡模酸、山楂酸、科罗索酸、齐墩果酸和熊果酸量，其RSD（n=6）分别为2.4%、1.9%、2.1%、1.4%和1.9%。结果表明，样品制备方法重复性良好。

2.6稳定性试验 精密称取线纹香茶菜全草样品约1.0 g，按“2.1.2”项下步骤制备样品溶液，分别在0、2、4、8、12、24 h进样，进样量20 μL，测定5种三萜酸的峰面积，计算得坡模酸、山楂酸、科罗索酸、齐墩果酸和熊果酸峰面积的RSD值分别为1.6%、1.7%、1.5%、2.1%和1.3%，表明样品溶液在24 h内稳定。

2.7加样回收率试验 精密称取已知坡模酸、山楂酸、科罗索酸、齐墩果酸和熊果酸含有量的线纹香茶菜样品（全草）6份，每份约0.5 g，分别加入对照品适量，按“2.1.2”项下步骤制备样品溶液，进样20μL测定5种三萜酸的峰面积，外标法计算，结果见表2。

2.8样品测定 精密吸取制备的样品溶液各20μL进样，连续进样3次，测定坡模酸、山楂酸、科罗索酸、齐墩果酸和熊果酸峰面积积分值，外标法计算5种三萜酸的量。测定结果见表3。

3　讨论

在线纹香茶菜样品不同部位中，5种三萜酸类成分含有量高低均依次为叶＞全草＞茎＞根。而同一部位中，坡模酸和熊果酸含有量高于其他3种三萜酸，且含有量差异较大，由测定结果可知三萜酸类成分主要存在于线纹香茶菜叶中。

本实验采用甲醇-乙酸水溶液体系的分离效果较好，乙酸形成的弱酸环境抑制了三萜酸类成分在流动相中的解离，组分色谱峰对称性良好。分析时采用等度洗脱，操作简便，分离度较好，且保留时间适中，单个样品分析可在25 min内完成。

表2　5种三萜酸成分的回收率（n=6）Tab.2 Results of recovery rates for five triterpenic acids（n=6）

表3　样品测定结果（mg/g）Tab.3 Quantitative determ ination of sam ples（mg/g）

坡模酸、山楂酸、科罗索酸、齐墩果酸和熊果酸均属三萜类化合物，且山楂酸和科罗索酸、齐墩果酸和熊果酸互为同分异构体，结构和极性相似，在C18色谱柱上保留时间相近。本实验建立RPHPLC法同时测定线纹香茶菜中的5种三萜酸成分时，优化流动相的配比和pH，有效地将5种三萜酸成分加以分离，样品中坡模酸、山楂酸、科罗索酸、齐墩果酸和熊果酸分离度均大于1.5。方法定量准确，操作简便，可用于同时测定线纹香茶菜样品中坡模酸、山楂酸、科罗索酸、齐墩果酸和熊果酸。

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Simultaneous determ ination of five triterpenic acids in different parts of Rabdosia lophanthoides by RP-HPLC

ZOU Sheng-qin， JIANG Qiong*
（Key Laboratory of Jiangxi Proυince for Research on Actiυe Ingredients in Natural Medicines，College of Chemistry and Bioengineering，Yichun Uniυersity，Yichun 336000，China）

AIM To establish the method for simultaneously determining pomolic acid，hawthorn acid，corosolic acid，oleanolic acid and ursolic acid in total grass，root，stem，and leaf of Rabdosia lophanthoides.METHODS The separation was achieved on a Kromasil C18column（4.6 mm×250 mm，5μm）at25℃using methanol-2.0%CH3COOH solution（88∶12，V/V）as themobile phase at a flow rate of1.0 mL/min.The detection wavelength was setat210 nm.RESULTS Linearities of pomolic acid，hawthorn acid，corosolic acid，oleanolic acid and ursolic acid were in the ranges of 0.552-41.4 mg/L（r=0.999 5），0.540-40.5 mg/L（r= 0.999 6），0.824-61.8 mg/L（r=0.999 9），2.444-183.3 mg/L（r=0.999 7）and 3.172-237.9 mg/L（r=0.999 7），respectively.The average recoveries were 98.1%，98.0%，96.3%，99.7%and 99.0%with RSD（n=6）less than 2.2%.CONCLUSION The five triterpenic acids from R.Lophanthoides distributed from high to low are leaf＞total grass＞stem＞root in turn.

Rabdosia lophanthoides；triterpenic acid；pomolic acid；hawthorn acid；corosolic acid；oleanolic acid；ursolic acid；RP-HPLC

文献标志码：A 文章编号：1001-1528（2015）03-0570-04

10.3969/j.issn.1001-1528.2015.03.024

2014-04-03

国家“863”计划重点资助项目（2002AA2Z3217）；江西省科技计划项目（2007BG07200）

邹盛勤（1970—），男，教授，硕士，研究方向为药物分析。Tel：13507058127，E-mail：zsqycxy@163.com

姜 琼（1980—），男，讲师，硕士，研究方向为天然产物研究与开发。Tel：13707050417，E-mail：qqj2000@163.com