吸入氢气对大鼠心肌缺血再灌注损伤的影响

张泉三+巩霞+王滨+等

[摘要] 目的 探讨吸入氢气对大鼠心肌缺血再灌注损伤的影响。 方法 40只雄性SD大鼠随机分为4组，每组10只，分别为：假手术组（SH组），缺血再灌注组（I/R组），1%氢气组（1%H2组），2%氢气组（2%H2组）。除SH组外，其他各组通过结扎左冠状动脉前降支30 min后恢复血流并持续120 min，制作大鼠缺血再灌注损伤模型。1%H2组、2%H2组在再灌注过程中持续吸入相应浓度的氢气。观察并记录缺血前（T0）、再灌注即刻（T1）、再灌注30 min（T2）、再灌注60 min（T3）、再灌注120 min（T4）各时点的心率（HR）、平均动脉压（MAP），并在再灌注120 min时从尾静脉抽取5 ml静脉血，进行血清肌酸激酶同工酶（CK-MB）、心肌肌钙蛋白I（cTnI）检测。随后处死大鼠取心脏，计算心肌梗死的面积，并采用酶联免疫吸附法（ELISA）测定心肌8-羟基脱氧鸟苷（8-OHdG）、高迁移率族蛋白1（HMGB1）、核因子-κB（NF-κB）、肿瘤坏死因子α（TNF-α）、白细胞介素6（IL-6）的浓度。 结果 各组HR在各时点的比较差异均无统计学意义（P>0.05）。与SH组比较，I/R组、1%H2组、2%H2组的梗死面积、CK-MB、cTnI、8-OHdG、HMGB1、NF-κB、TNF-α、IL-6显著升高，而MAP水平降低（P<0.05）。与I/R组比较，1%H2组、2%H2组的梗死面积、CK-MB、cTnI、8-OHdG、HMGB1、NF-κB、TNF-α、IL-6显著降低，MAP水平升高（P<0.05）。1%H2组和2%H2组组间比较各观察指标差异无统计学意义（P>0.05）。 结论 吸入氢气能减轻大鼠心肌缺血再灌注损伤，其机制可能与抑制氧化应激损伤、炎性反应有关。

[关键词] 氢；心；缺血再灌注损伤

[中图分类号] R692 [文献标识码] A [文章编号] 1674-4721（2015）09（c）-0007-04

Impact of inhaling hydrogen on rats with myocardial ischemia reperfusion injury

ZHANG Quan-san GONG Xia WANG Bin ZHANG Cong-cong CHEN Xin-xin ZHU Jian-chang▲

Department of Emergency，Qingdao Municipal Hospital，Qingdao 266011，China

[Abstract] Objective To explore the impact of inhaling hydrogen on rats with myocardial ischemia reperfusion injury rat. Methods 40 male rats were randomly divided into 4 groups： sham-operated group （SH group），ischemia reperfusion group （I/R group），1% hydrogen group （1%H2 group） and 2% hydrogen group （2%H2 group），each group had 10 rats.Apart from SH group，ischemia reperfusion injury rats model were made by ligation left anterior descending coronary artery for 30 min and then restored blood flow for continuing 120 min.Appropriate concentration of hydrogen were continuous inhaled in 1%H2 group and 2%H2 group.Heart rate （HR） before ischemia （T0），immediate reperfusion （T1），reperfusion for 30 min （T2），reperfusion for 60 min （T3） reperfusion for 120 min （T4） and mean arterial pressure （MAP） were observed and recorded.5 ml venous blood was extracted at 120 min after reperfusion.Creatine kinase-MB （CK-MB） and cardiac troponin I （cTnI） were tested.Then the rats were killed and hearts were removed.The area of myocardial infarction area was calculated and the levels of 8-hydroxy-2′-deoxyguanosine （8-OHdG），high mobility group box 1 （HMGB1），nuclear factor-kappa B （NF-κB），tumor necrosis factor α （TNF-α） and interleukin-6 （IL-6） were tested by enzyme linked immunosorbent assay （ELISA）. Results The HR had no significant difference at different time among 4 groups.Compared with SH group，the infarction area，lelves of CK-MB，cTnI，8-OHdG，HMGB1，NF-κB，TNF-α and IL-6 in I/R group，1%H2 group and 2%H2 group significantly increased，while the level of MAP decreased （P<0.05）.Compared with I/R group，the infarction area，levels of CK-MB，cTnI，8-OHdG，HMGB1，NF-κB，TNF-α and IL-6 in 1%H2 group and 2%H2 group significantly decreased，while the level of MAP increased （P<0.05）.The index between 1%H2 group and 2%H2 group had no significant difference （P>0.05）. Conclusion Inhaling hydrogen can alleviate myocardial ischemia reperfusion injury in rat.The mechanism may be related to inflammatory reaction and inhibit oxidative stress injury of hydrogen.

[Key words] Hydrogen；Heart；Ischemia reperfusion injury

近年来，随着心肌梗死后溶栓治疗、经皮冠状动脉介入治疗术（PCI）不断在临床中普及，心肌缺血后的再灌注可能造成缺血部分心肌发生更严重的损伤，如心力衰竭、血压下降，甚至心跳骤体等，严重影响患者的临床预后。因此，由其引起心肌缺血再灌注损伤越来越引起人们的重视[1-2]。氢气是一种生理惰性气体，具有还原性。近来，有研究表明其抗原性在临床治疗缺血再灌注损伤中有特殊作用[3]。本研究探讨氢气对心肌缺血再灌注损伤的影响，为临床预防缺血再灌注损伤提供新的思路。

1 资料与方法

1.1 一般资料

40只健康成年SD大鼠，体重（210±25）g，购自北京维通利华实验动物中心。通过随机数字法分为4组，每组10只，分别为：假手术组（SH组）、缺血再灌注组（I/R组）、1%氢气组（1%H2组）和2%氢气组（2%H2组）。

1.2 方法

大鼠称重，通过腹腔注射20%的乌拉坦（0.5 ml/100 g）麻醉，将大鼠四肢固定在手术台上，通过四肢皮下电极监测心电图的变化。分离颈部组织，暴露气管、右颈总动脉和颈内静脉。右颈总动脉置入24G导管，通过压力换能器监测心率（HR）和平均动脉压（MAP）。切开气管，连接动物HX-300呼吸机（成都泰盟科技有限公司），潮气量为3 ml/100 g，呼吸频率为60～65次/min，吸呼比（I∶E）为=1∶1。在胸骨左缘2、3、4肋间手术，暴露心脏，剪开心包。在左心耳下方寻找冠状动脉前降支，用6/0丝线穿过冠状动脉前降支，并在线与动脉间放一个硅胶管并结扎，SH组只穿线不结扎。以结扎后心肌颜色变苍白，心电图出现ST段抬高为缺血的标准，以松开结扎线心肌变红润，心电图ST段下降为再灌注的标志。缺血30 min后松开结扎线再灌注120 min。通过PGH-300氢气发生器（北京谱莱析科技有限公司）电解水产生氢气，纯度为99.999%。用吸氧管将产生的氢气连接到呼吸机的管道上。在近气管处的管道上用GT901-氢气泵吸式氢气检测仪（东莞市永琪电子设备有限公司）监测并调定吸入管道氢气的浓度。1%H2组和2%H2组在再灌注过程中吸入相应浓度的氢气。

1.3 观察指标

1.3.1 血流动力学的监测 观察并记录在心肌缺血前（T0）、再灌注即刻（T1）、再灌注30 min（T2）、再灌注60 min（T3）、再灌注120 min（T4）各时点的心率（HR）、平均动脉压（MAP）。

1.3.2 心肌酶标志物的监测 在再灌注120 min从右颈总动脉抽取静脉血3 ml，3500 r/min离心后取上清液，酶联免疫吸附法（ELISA）测定血清肌酸激酶同工酶（CK-MB）和心肌肌钙蛋白I（cTnI）的水平，操作严格按照试剂盒说明书。试剂均来源于美国R&D公司。

1.3.3 大鼠心肌梗死面积的测定 再灌注结束取血液样本后处死大鼠，取出心脏。随机选取5只大鼠的心脏，用预冷生理盐水冲净心腔血液干净，用滤纸吸干，剪去心房、左室游离壁及脂肪组织，称重。把左心室心肌横切成5～6片，浸入含有氯化硝基四氮唑蓝（NBT）的磷酸缓冲液中，然后放入37℃水浴中，等待完全染色后取出，用滤纸吸干。缺血组织不染色，正常组织染色。缺血心肌剪下称重，以缺血心肌与左心室湿重的百分比表示梗死面积（MIS）。

1.3.4 大鼠心肌组织中生化指标的监测 剩余5只大鼠心脏在结扎点下剪下缺血区心肌组织，加入预冷的生理盐水制成10%组织匀浆，在4000 r/min离心后取上清液。采用ELISA法测定心肌8-羟基脱氧鸟苷（8-OHdG）、高迁移率蛋白1（HMGB1）、核因子-кB（NF-κB）、肿瘤坏死因子α（TNF-α）、白细胞介素6（IL-6）的含量，操作严格按照试剂盒说明书。试剂均来源于美国R&D公司。

1.4统计学处理

采用统计软件SPSS 17.0对实验数据进行分析，计量资料以均数±标准差（x±s）表示，采用t检验，组内比较采用重复测量设计的方差分析，组间比较采用单因素方差分析。计数资料以率表示，采用χ2检验。以P<0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 各组不同时点血流动力学指标的比较

HR在各组各时点的比较差异均无统计学意义（P>0.05）；除SH组外，各组与 T0 比较，MAP都显著下降（P<0.05）；与SH组比较，各组的MAP均显著降低（P<0.05）；与I/R组比较，1%H2组和2%H2组的MAP均显著升高（P<0.05）；1%H2组和2%H2组组间比较差异无统计学意义（P>0.05）（表1）。

表1 各组不同时点血流动力学指标的比较（x±s，n=10）

与同时点SH组比较，#P<0.05；与同组T0比较，★P<0.05

2.2 各组血清CK-MB、cTnI及MIS的比较

与SH组比较，I/R组、1%H2组、2%H2组的CK-MB、cTnI和MIS均显著升高（P<0.05）；与I/R组比较，1%H2组和2%H2组的CK-MB、cTnI和MIS均显著降低（P<0.05）；1%H2组和2%H2组组间比较差异无统计学意义（P>0.05）（表2）。

表2 各组血清CK-MB、cTnI和MIS的变化（x±s，n=10）

与SH组比较，*P<0.05；与I/R组比较，#P<0.05

2.3 各组心肌组织中生化指标的比较

与SH组比较，8-OHdG、HMGB1、NF-κB、TNF-α、IL-6均显著升高（P<0.05）；与I/R组比较，1%H2组和2%H2组的8-OHdG、HMGB1、NF-κB、TNF-α、IL-6显著降低（P<0.05）；1%H2组和2%H2组组间比较差异无统计学意义（P>0.05）（表3）。

表3 各组心肌组织中生化指标的比较（x±s，n=10）

与SH组比较，*P<0.05；与I/R组比较，#P<0.05

3 讨论

本研究参考文献方法[4]，采取结扎左冠状动脉前降支30 min后再灌注120 min来制备大鼠心肌缺血再灌注损伤的模型，根据心电图ST段的变化确定模型制作成功。

氢气是一种较氧气分子更小呈电中性的分子，它具有更好的膜通透性，可以更好地进入细胞内，能清除羟自由基、超氧阴离子，预防器官的缺血再灌注损伤[5～6]。由于氢气的半衰期短，所以只能在持续吸入氢气时才能发挥其抗氧化作用[7-8]。本研究在再灌注全程中持续吸入1%H2、2%H2，实验结果显示，结扎冠状动脉前降支后，心功能出现异常，而1%H2组和2%H2组能改善心功能的异常情况。和I/R组比较，心肌酶（CK-MB、cTnI）和MIS均显著降低（P<0.05），表明氢气能减轻心肌损伤的程度，而不同浓度氢气组间比较无明显差异，表明吸入氢气可能会减轻心肌缺血再灌注损伤。

心肌缺血再灌注损伤发病机制复杂，其中氧化应激是其最主要的发生机制之一[9]。当心肌发生缺血再灌注损伤时，在早期产生大量活性氧簇（ROS），过多的ROS导致脂质过氧化及DNA的损伤，进而导致细胞凋亡和坏死[10]。8-OHdG是DNA氧化应激损伤最重要的标志物，是评价机体DNA氧化应激和机体氧化损伤的敏感指标[11～12]。本研究中，和SH组比较，各组8-OHdG均有不同程度的升高（P<0.05），表明在心肌再灌注损伤中DNA氧化应激发挥了重要作用。与I/R组比较，各氢气组8-OHdG均降低（P<0.05），提示吸入氢气可能通过减轻DNA氧化应激和机体氧化损伤来减轻心肌的缺血再损伤。

既往研究表明，炎症是心肌缺血再灌注损伤的机制之一[13]。HMGB1是存在于细胞的一种核蛋白质，它在机体炎性反应时发挥重要作用[14]。HMGB1作为Toll样受体4（Toll-like receptor 4，TLR4）的内源性配体，它激活TLR4信号通路，通过多种途径最终激活NF-κB，引起炎症细胞因子如TNF-α、IL-6的释放[15]。TNF-α、IL-6是机体十分重要的炎症因子，在炎症过程中发挥着重要作用[16～17]。HMGB1在缺血再灌注损伤中起重要作用[18]。本次研究发现，吸入氢气组，HMGB1、NF-κB、TNF-α、IL-6较I/R组明显下降（P<0.05），表明它可能在再灌注损伤中发挥一定作用，吸入氢气可能通过抑制心肌组织的炎性反应来减轻心肌缺血再灌注损伤。

综上所述，吸入氢气能减轻大鼠心肌缺血再灌注损伤，其机制可能和抑制氧化应激损伤与炎性反应有关。

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（收稿日期：2015-05-21 本文编辑：卫 轲）