反相流动注射抑制化学发光法测定头孢唑啉钠

瞿 鹏, 瞿昊宏, 宋凌霄, 田爱华

(1.商丘师范学院化学化工学院，纳米生物分析化学河南省高校重点实验室培育基地，河南商丘 476000； 2.商丘市第一高级中学，河南商丘 476000； 3.郑州大学化学与分子工程学院，河南郑州 450052)

头孢唑啉为第一代头孢菌素，其抗菌谱广，适用于治疗敏感细菌所致的中耳炎、支气管炎、肺炎、尿路感染、皮肤软组织感染及眼、耳、鼻、喉等感染[1]，也可作为外科手术前的预防用药[2]。因此，建立快速、准确、灵敏的头孢唑啉钠分析方法在临床医学及药理学研究方面有重要的实际意义。

目前常用的头孢唑啉的测定方法有分光光度法[3，4]、电化学法[5]、高效液相色谱法[6，7]、毛细管电泳法[8]等。但这些方法都存在灵敏度低和操作繁琐等缺点。近年来，流动注射化学发光分析法由于其灵敏度高、分析速度快、方法简便等特点，被用于测定头孢唑啉钠[9，10]，但方法的灵敏度还有待提高。由于头孢唑啉钠能强烈地抑制鲁米诺-磷钼钒杂多酸体系的化学发光，因此本文提出了一种鲁米诺-磷钼钒杂多酸化学发光体系，结合流动注射分析技术测定了药物针剂中头孢唑啉钠含量。

1 实验部分

1.1 仪器与试剂

弱化学发光仪(中国科学院生物物理研究所)。

图1 头孢唑啉钠测定系统示意图Fig.1 Schematic diagram of flow injection system for sodium cefazolin determinationa:luminol and sodium hydroxide；b:sample；c:vanadomolybdophosphoric heteropoly acid；P：peristaltic pump；V：six-way injection valve；F：flow cell；W:waste；DC：detector；PC：personal computer.

头孢唑啉钠标准贮备溶液(上海化学试剂总厂)：2.0×10-4g/mL；鲁米诺储备溶液：5.0×10-2mol/L，用0.1 mol/L NaOH溶液配制；磷酸二氢钠溶液：1.0×10-3g/mL；钼酸铵溶液：2.0×10-3mol/L；钒酸钠溶液：2.0×10-3g/mL；H2SO4：1 mol/L；NaOH溶液：2 mol/L。所有试剂均为分析纯，水为二次蒸馏水。

1.2 实验方法

如图1所示，蠕动泵以2.0 mL/min的流速输送所有试液。内径为0.8 mm的PTFE管在流通体系中作为连接元件。开启蠕动泵清洗流路至稳定，将110 μL鲁米诺和NaOH的混合溶液通过六通阀注入载流，然后与试样和磷钼钒杂多酸混合产生化学发光。试样的浓度通过相对化学发光强度来定量。发光信号用计算机控制的化学发光仪检测和记录。

2 结果与讨论

2.1 磷钼钒杂多酸的形成条件

2.1.1磷酸二氢钠浓度的影响磷是磷钼杂多酸的中心元素，磷酸二氢钠的浓度极大地影响磷钼杂多酸的浓度，进而影响化学发光的信号。磷酸二氢钠浓度对相对发光强度的影响如图2所示。当磷酸二氢钠浓度为1.0×10-5g/mL时，相对发光强度最大，故本文选择磷酸二氢钠浓度为1.0×10-5g/mL。

2.1.2钼酸铵浓度的影响钼酸铵浓度影响磷钼杂多酸的络合比，进而影响杂多酸的氧化能力和相对化学发光强度。研究发现，随着钼酸铵浓度的增大，相对发光强度逐渐增大，但当钼酸铵浓度大于 3.0×10-4mol/L时相对发光强度反而减小(图3)，所以本文选择钼酸铵的浓度为 3.0×10-4mol/L。

图2 磷酸二氢钠浓度对相对发光强度的影响Fig.2 Effect of NaH2PO4 concentration on relative CL intensity

图3 钼酸铵浓度对相对发光强度的影响Fig.3 Effect of (NH4)6Mo7O24 concentration on relative CL intensity

图4 钒酸钠浓度对相对发光强度的影响Fig.4 Effect of sodium vanadate concentration on relative CL intensity

2.1.3钒酸钠浓度的影响在磷钼杂多酸中加入钒酸钠，可以形成具有更强氧化能力的磷钼钒杂多酸，使化学发光强度增强，进而使加入样品后的相对发光强度差值更大。实验中发现钒酸钠浓度为2.0×10-6g/mL时相对化学发光强度最大(图4)，故本文选择2.0×10-6g/mL作为钒酸钠的浓度。

2.1.4H2SO4浓度的影响H2SO4浓度影响杂多酸的形成、稳定性及氧化性，进而也影响化学发光反应。本文考察了H2SO4浓度对相对发光强度的影响。实验结果表明：随硫酸浓度的增大，相对发光强度也在不断变化，当H2SO4的浓度为0.01 mol/L时，相对发光强度最大，故本文选择H2SO4的浓度为0.01 mol/L。

2.2 NaOH浓度的影响

NaOH是发光反应的介质，所以其浓度是影响测量灵敏度的重要因素。实验表明NaOH溶液浓度在0.05～0.15 mol/L 范围内相对发光强度较大且信号稳定。另外考虑到试剂消耗和环境的因素，本试验中选择NaOH溶液的浓度为0.1 mol/L。

2.3 鲁米诺浓度的影响

鲁米诺(Luminol)浓度与测量的灵敏度、重现性直接相关。在选定的条件下测定不同浓度鲁米诺对相对发光强度值的影响，结果表明在鲁米诺浓度小于5.0×10-4mol/L时相对发光强度随鲁米诺浓度增大而增大，当浓度大于5.0×10-4mol/L 时，相对发光强度基本不变。另外考虑到试剂消耗的因素(图5)，本文选择鲁米诺浓度为5.0×10-4mol/L。

2.4 流速的影响

在流动注射分析中，流速是影响测定灵敏度的一个重要因素。本实验考察了在0.5～4.0 mL/min范围内流速对相对发光强度的影响。实验结果表明：流速增大，相对化学发光强度也增大，因为该化学发光反应是一个快反应，流速太慢，不利于其灵敏度。但实验中也发现流速大于2.0 mL/min时相对发光强度增加很少(图6)；另外考虑到分析效率和试剂消耗，本文选择2.0 mL/min作为载流的流速。

图5 鲁米诺浓度对相对发光强度的影响Fig.5 Effect of Luminol concentration on relative CL intensity

图6 流速对相对发光强度的影响Fig.6 Effect of flow rate on relative CL intensity

2.5 体系的分析特性

在本文选定的实验条件下，头孢唑啉钠的浓度在3.0×10-7～8.0×10-5g/mL范围内与相对发光强度呈良好的线性关系。回归方程为：Y=566.5+282.5X(×10-5g/mL)，相关系数r=0.9997，检出限为8.0×10-8g/mL。对5.0×10-6g/mL的头孢唑啉钠进行11 次平行测定，相对标准偏差(RSD)为3.8%。

2.6 干扰实验

2.7 样品分析

分别取深圳九新药业有限公司2种不同批号的注射用五水头孢唑啉钠，以及哈药集团制药总厂的2种不同批号的注射用头孢唑啉钠的2种粉针剂进行测定，每个样品平行测定5次，同时进行标准加入回收率实验。结果如表1所示，回收率在97.0%～102.5%之间，RSD小于3.8%(n=5)。实验结果表明，标示量与检测量之间无显著性差异，该方法可以用于不同头孢唑啉钠粉针剂的含量测定。

表1 头孢唑啉钠的测定结果(n=5)

a:the relative stundard deviation (RSD,%).

3 总结

基于头孢唑啉钠能抑制磷钼钒杂多酸氧化鲁米诺产生化学发光的现象，结合流动注射分析技术，提出了一个测定头孢唑啉钠的化学发光新体系。头孢唑啉钠在3.0×10-7～8.0×10-5g/mL浓度范围内与化学发光信号呈线性关系；检出限为8.0×10-8g/mL。该方法快速、灵敏，线性范围宽，已经被成功地应用于药物针剂中头孢唑啉钠的测定。