固相萃取-超高效液相色谱/串联质谱法测定人体血清中7种全氟化合物

肖永华*， 梁高道， 革丽亚， 黄常刚， 王 胜， 麦 琦

(武汉市疾病预防控制中心，湖北武汉 430022)

全氟化合物(Perfluorinated Compound，PFCs)是一类氟化有机物，它具有疏水、疏油、热稳定性及化学稳定性好、表面活性高，已广泛应用于工业生产与消费领域。有报道称含氟聚合物生产厂以及污水处理厂是全氟化合物的主要污染源[1]。研究表明，PFCs在鱼肉、虾、猪肉、鸡蛋以及饮用水中均有检出，同时PFCs具有很高的稳定性，在环境中不易被降解，进入生物体后会随着食物链不断累积，而人类处于食物链的最末端，所摄入的PFCs要远远高于其他生物体。毒理学研究表明，PFCs在一定剂量下具有肝毒性、免疫毒性、神经毒性、内分泌干扰效应及潜在致癌性等多种毒性效应[2]。随着PFCs的污染越来越受到重视，因此通过检测人体血清中PFCs的含量来评价人群PFCs的暴露具有重要的意义。

目前检测PFCs大多采用液相色谱-串联质谱法[3 - 18]，其优点是抗干扰能力强、选择性好、灵敏度高，在检测痕量PFCs时具有显著的优势。在样品处理时采用较多的有石墨化炭黑分散萃取[2]、酸水解[3]、碱水解[4]、离子对试剂提取[5]以及聚酰胺粉提取[6]等。在上述研究的基础上，本实验采用酶解法来提取血清中PFCs，提取液经沉淀蛋白以及WAX固相萃取小柱净化后，采用超高效液相色谱/串联质谱法测定。该方法能有效地去除基质干扰，稳定性好，准确度高，可作为评价人群PFCs暴露的重要技术支撑。

1 实验部分

1.1 主要仪器与试剂

UPLC-TQD超高效液相色谱/串联质谱仪(美国，Waters公司)，配备电喷雾离子源(ESI)及Masslynx4.1数据处理系统；AL204电子天平(瑞士，Mettler Toledo公司)；固相萃取装置(美国,Agilent公司)；氮气吹干仪(美国,Organomation Associates公司)；涡旋仪(德国,IKA公司)；电热恒温培养箱(上海一恒科学仪器有限公司)；低速台式离心机(科大创新股份有限公司中佳分公司)。

标准品：全氟己烷磺酸(PFHxS)、全氟庚酸(PFHpA)、全氟辛酸(PFOA)、全氟辛烷磺酸(PFOS)、全氟壬酸(PFNA)、全氟癸酸(PFDA)、全氟十一酸(PFUnDA)，均购自Sigma-Aldrich公司；内标：13C4全氟辛酸(MPFOA)、13C4全氟辛烷磺酸(MPFOS)，均购自美国Sigma公司。β-葡萄糖醛苷酶(美国Sigma公司)；甲醇、乙腈(色谱纯，美国天地公司)；NaAc、NaOH、NH4Ac(分析纯，国药集团化学试剂有限公司)；HClO4(优级纯，天津市东方化工厂)；氨水(分析纯，开封东大化工有限公司试剂厂)；WAX固相萃取小柱(60 mg，3 mL，美国Waters公司)。实验用水为超纯水。

1.2 标准溶液配制

标准、内标储备液(100 mg/L)：分别准确称取0.0100 g全氟化合物标准品于100 mL棕色容量瓶中，用甲醇溶解并稀释至刻度；内标用甲醇溶解，转移至100 mL棕色容量瓶中，-18 ℃冷冻保存。标准、内标中间液(1 mg/L)：分别准确吸取1.00 mL储备溶液于100 mL棕色容量瓶中，用甲醇稀释至刻度，4 ℃保存。内标工作液(50 μg/L)：准确吸取5.00 mL内标工作液于100 mL棕色容量瓶中，用甲醇稀释至刻度，4 ℃保存。标准工作液：临用时将标准中间液稀释至合适浓度标准系列，标准系列中内标浓度均为5 μg/L。

1.3 样品处理

称取1.00 g血清样品于15 mL离心管中，加入5.0 mL 0.2 mol/L的NaAc缓冲溶液以及100 μL内标工作液，充分混匀，再加入50 μLβ-葡萄糖醛苷酶，混匀后，于温度37 ℃酶解提取12 h。在提取液中加入200 μL HClO4，充分涡旋后离心10 min，将上清液转移至另一15 mL离心管中，用NaOH溶液调节溶液pH值至中性。

将WAX固相萃取小柱分别用3 mL甲醇和3 mL水活化后，取提取液过柱，用5 mL 50%甲醇水溶液淋洗，最后用5%氨水甲醇溶液洗脱，洗脱液经氮气吹干后用1.0 mL甲醇溶解，以0.22 μm滤膜过滤后，用超高效液相色谱/串联质谱仪进行分析。

1.4 仪器条件

1.4.1色谱条件色谱柱：ACQUITY UPLC®HSS C18柱(100×2.1 mm,1.8 μm)；流动相：A：乙腈，B：5 mmol/L NH4Ac缓冲溶液。梯度洗脱程序：0～3.0 min,30%～70%A;3.0～6.0 min,70%A;6.0～6.1 min，70%～30%A;流速：0.2 mL/min；柱温：30 ℃；进样量：10 μL。

1.4.2质谱条件离子源：电喷雾(ESI)，负离子模式；毛细管电压：-2.3 kV；脱溶剂气温度：350 ℃；离子源温度：120 ℃；扫描模式：多反应监测(MRM)。采用质谱直接进样的方式优化各全氟化合物的采集参数，7种全氟化合物及2种内标的MRM参数见表1。

表1 7种全氟化合物及2种内标的MRM参数Table 1 The MRM parameters of 7 PFCs and 2 internal standards

2 结果与讨论

2.1 流动相的选择

图1 7种全氟化合物及2种内标的总离子流色谱图(TIC)Fig.1 TIC of 7 PFCs and 2 internal standards 1,2：PFHxS，PFHpA；3,4：MPFOA，PFOA；5,6,7.PFOS，MPFOS，PFNA；8：PFDA；9：PFUnDA.

实验比较了甲醇-NH4Ac缓冲溶液和乙腈-NH4Ac缓冲溶液两种体系的分离效果、灵敏度以及背景干扰。结果表明，在这两种体系中，PFCs各组分峰形良好，灵敏度没有明显差异。但在甲醇-NH4Ac缓冲体系中，PFNA、PFOA以及PFHxS存在背景干扰现象，而乙腈-NH4Ac缓冲体系中没有明显的背景干扰，因而本实验选择乙腈-NH4Ac缓冲溶液体系作为流动相。PFCs各组分的总离子流色谱图见图1。

2.2 样品前处理的优化

文献报道样品处理时采用较多的有酸水解、碱水解、离子对试剂提取以及石墨化炭黑分散萃取等。由于PFCs与蛋白结合在一起，常规的乙腈沉淀蛋白不能有效地提取血清中的PFCs，在回收率实验中，血清样品加入7种全氟化合物及2种内标后，通过乙腈沉淀蛋白，离心后取上清液直接测定时7种全氟化合物及2种内标的响应值均明显降低，回收率均小于50%。因而本实验首先利用酶解的方法使与蛋白相结合的PFCs 释放出来，再加入HClO4沉淀蛋白质，离心后上清液用NaOH溶液调节至中性，将溶液过WAX固相萃取小柱，用3.0 mL 50%甲醇水溶液淋洗小柱，最后用3.0 mL 5%氨水甲醇溶液作为洗脱液洗脱小柱所吸附的PFCs(本实验曾分别用3.0 mL 5%氨水甲醇溶液洗脱两次，结果发现所有PFCs组分均在第一次被完全洗脱下来)，洗脱液经氮气吹干后用1.0 mL甲醇复溶。

2.3 线性范围、回收率、精密度及检出限

全氟羧酸类化合物PFHpA、PFOA、PFNA、PFDA、PFUnDA以MPFOA为内标，全氟磺酸类化合物PFHxS、PFOS以MPFOS为内标，7种全氟化合物在1.0～50.0 μg/L范围内线性关系良好，相关系数均在0.995以上；在血清样品中添加浓度为25 μg/kg的7种全氟化合物标准，内标MPFOS和MPFOA的添加浓度均为5 μg/kg，分别做6个加标平行样和2个血清本底，7种全氟化合物的平均回收率为74.0%～105.6%，结果见表2。通过逐级稀释法来确立本方法的检出限，当7种PFCs进样浓度为0.05 μg/L时，7种PFCs的信噪比均大于3，经回收率校正后，选择0.1 μg/kg作为本方法7种PFCs的检出限。

表2 7种PFCs的回归方程、线性范围、相关系数及回收率(n=6)Table 2 Regression equations,linear ranges,correlation coefficients and recoveries of 7 PFCs(n=6)

2.4 实际样品的测定

随机选择24位本单位健康体检人群的血清样品测定PFCs，结果表明：PFHxS、PFOA、PFNA、PFOS、PFDA、PFUnDA均有检出。PFOA、PFNA、PFOS、PFDA、PFUnDA检出率均为100%，其中PFOA和PFOS的含量要远高于其他4种PFCs。血清中PFHpA均未检出，检出情况详见表3。血清样品中PFOA和PFOS多反应监测(MRM)色谱图见图2。

图2 人体血清样品中PFOA和PFOS多反应监测(MRM)色谱图Fig.2 MRM chromatograms of PFOA and PFOS in human serum samples

表3 人体血清样品中7种PFCs的测定结果Table 4 Determination results of 7 PFCs in human serum samples

3 结论

随着食物链的富集，人体中的PFCs含量要远高于环境以及食品中PFCs的含量，如何通过保护以及改善环境来控制和降低人群PFCs的摄入量，需要引起更多人的重视。本文通过对样品前处理、色谱以及质谱条件的优化，建立了固相萃取-超高效液相色谱/串联质谱法测定人体血清中7种PFCs的分析方法。该方法灵敏度高，准确度好，可作为人群PFCs暴露监测的技术支撑。