不同制备工艺对双黄连口服液有效成分含量及药效的影响

王　彬，韩　露，付文力，李灵娟，柴保国

（1.河南牧翔动物药业有限公司，河南 郑州　451162；2.河南省畜牧总站）

不同制备工艺对双黄连口服液有效成分含量及药效的影响

王彬1*，韩露2，付文力1，李灵娟1，柴保国1

（1.河南牧翔动物药业有限公司，河南 郑州451162；2.河南省畜牧总站）

当前家禽养殖实践中，感冒作为高发性疾病常常给实际生产造成巨大损失，严重危害养禽业健康，已经成为影响当前家禽生产效益的主要疾病之一。感冒类疾病通常分为两类：一类为因季节交替、冷热交替、免疫应激等非传染性因素引起鸡群发病导致的普通感冒，以甩鼻、呼噜症状为主，若表证不除，郁而化热感染外邪则会发展成流行性感冒（风热感冒），并进一步导致复合感染，造成其他脏器损伤；另一类为因新城疫及传支病毒等传染性因素引起的发热、咳嗽、呼吸困难等流行性感冒类，患禽主要表现为低死亡率和轻度的呼吸道感染或产蛋率下降等临床症候群，全身器官病变迅速且严重，尤其是心、肺、肾等脏器，免疫系统也遭到破坏，继发细菌感染后易致病程延长，甚至出现高死淘现象。

双黄连口服液源于《石室密录》载方连翘汤，早在战争年代，人医上已用于治疗流感、感冒及多种感染病症；现代药理证实，该药具有抗病毒、抗菌、解热抗炎、提升机体免疫力等多靶点综合治疗作用，是人医及兽医临床用于防治感冒及上呼吸道感染的代表性中成药之一。酶解法制备双黄连系《中华人民共和国兽药典（2010年版二部）》传统工艺基础上创新应用酶解法专利制备工艺（公开号：CN103520284A、CN102895317A）制得的双黄连口服液。该文主要从不同制备工艺对双黄连口服液药效学影响角度，对通过酶解工艺制备双黄连口服液在家禽感冒、免疫应激方面的防治效果方面进行研究。

1　材料

1.1药物

黄芩、金银花、连翘药材，购于郑州市张仲景大药房，经检验均符合《中华人民共和国兽药典（2010年版二部）》质量标准；提取用盐酸、氢氧化钠、乙醇均为分析纯，购自深圳某公司；生物酶由上海某公司提供Celluclast（纤维素酶）CC102025，活性度为20 000 U/g，

Pentopan Mono BG（木聚糖酶）CF102399，活性度为30 000 U/g；双黄连口服液（250毫升/瓶），某公司生产（酶 解 法 制备，批号 13060107H、13070507H、13100207H、14060108H）。

1.2试剂

黄芩苷对照品（批号：110715-201215），黄芩素对照品（批号：111595-201005），绿原酸对照品（批号：110753-201314），咖啡酸对照品（批号：110885-201302）木犀草素对照品（批号：111520-201309）连翘苷对照品（批号：110821-201211），以上标准品均购自中国药品生物制品检定所；其他试剂均为色谱纯。

1.3仪器

岛津LC-10ATvp高效液相色谱仪；SPD-10Avp紫外可见检测器；CLSS-VP色谱工作站；CTO-10ASvp柱温箱；7725i手动进样器；中药提取设备；管式离心机；中空纤维滤膜；中药浓缩罐，均为湖南某医药设备有限公司。

2　试验方法

2.1双黄连口服液不同提取工艺样品制备

处方：黄芩900 g、金银花900 g、连翘1 800 g，最终制备成2 400 ml药液。

水提醇沉法（简称水醇法，下同）：称取以上同批次3种生药，按现有2010版兽药典二部中所示加水煎煮、醇沉洗脱、浓缩过滤、灌装灭菌等工艺流程进行制备，样品保留3个重复；酶解-三级复合物理除杂法（简称酶解法，下同）：称取以上同批次3种生药，按照授权发明专利（公开号：CN103520284A、CN102895317A）进行加水煎煮、酶解（纤维素酶、木聚糖酶）、灭酶、三级物理除杂、浓缩过滤、灌装灭菌等工艺流程制备的双黄连口服液，样品保留3个重复。

2.2色谱条件

采用Kromasil C18（250 mm×4.6 mm，5μm）色谱柱，以乙腈（A）-1%冰醋酸溶液（B）为流动相梯度洗脱∶15%A（0 min），25%A（15 min），30%A（20 min），40%A（25 min），40%A（35 min），60%A（45min），检测波长为280 nm，参比波长：380 nm，流速为1.0 ml/min，进样量为10μl，柱温为30℃。理论板数不低于10 000。

2.3溶液的制备

2.3.1供试品溶液的制备精密称取不同制备工艺的双黄连口服液样品各2.0 ml，分别加50%甲醇25 ml，超声处理30 min，过滤，即得。

2.3.2对照品溶液的制备精密称取黄芩苷、黄芩素、绿原酸、咖啡酸、木犀草素、连翘苷对照品制成混合对照品溶液（浓度为黄芩苷1.06 mg·ml-1，黄芩素0.083 mg·ml-1，绿原酸0.26 mg·ml-1，咖啡酸0.080 mg·ml-1，木犀草素0.065 mg·ml-1，连翘苷0.13 mg·ml-1）。

2.3.3空白溶液制备取溶剂50%甲醇25 ml，按“3.3.1”项下方法制成空白对照溶液。

2.4不同制备工艺对双黄连口服液药效作用的影响

2.4.1风热感冒治疗

德惠市南郊某肉鸡自养场，大肉食肉鸡，3栋鸡舍，每栋10 000只。18日龄时3栋鸡舍大群均出现发病症状，症见发病鸡表现体温升高，精神沉郁，羽毛松乱，头颈卷缩，冠及肉髯发绀，眼睑水肿，结膜发炎。采食量减少或急骤下降，排黄白绿色稀便。呼吸困难，有啰音，咳嗽、打喷嚏，张口呼吸，鼻孔流出黏性鼻液，剖检发现呼吸道尤其是鼻窦，出现炎症，气管黏膜充血，每栋鸡舍发病情况大致类似，驻场兽医诊断为风热感冒。将3栋鸡

舍随机分为3组，分别按照表1所示用药方式进行用药，对试验鸡只按照以下疗效评价标准（见表后），进行评价打分，并统计试验结果，采用SPSS13.0进行单因素方差分析。

表1　风热感冒临床试验各组及用药情况

治愈率：在用药5 d内，经用药后临床症状基本消失，精神和采食情况恢复正常者，判定为治愈；每组治愈鸡只数占每组试验鸡只数的百分率为治愈率。

显效率：除完全治愈的鸡只为有效外，凡试验期间未死亡，并且症状明显减轻，粪便、精神有所好转，饮水和食欲趋于正常者也视为有效；每组存活且治疗有效的鸡只数占每组试验鸡只数的百分比为有效率。

死亡率：凡在试验期间死亡，剖检有特征性病变者判为死亡；死亡鸡只数占每组试验鸡只数的百分率为死亡率。

2.4.2免疫应激引起的普通感冒预防

山东章丘某商品蛋鸡自养场，6栋鸡舍，每栋5 000只，220日龄海兰褐开产蛋鸡，随机选取同朝向3栋鸡舍分为3组，防疫前5 d使用药物，按照标准化蛋鸡防疫流程进行防疫（200～220 d，新城疫-H9二联油苗0.5毫升/只颈部或胸部皮下注射），各组药物3 d一个疗程，观察各组预防家禽疫苗免疫应激产生呼吸道效果，并依据上述疗效评价标准进行结果统计。

通常应激反应有甩头、流泪、打喷嚏、呼噜、咳嗽等症状，这种反应在免疫接种2 d出现，之后一周内反应较重，以后逐渐减轻，有的会出现精神不振、采食减少、排绿色粪便等现象，严重的会引起死亡。依据临床用药程序，按照表2所示三组不同用药方式进行用药。

表2　预防免疫应激感冒试验分组情况

3　结果与讨论

3.1不同提取工艺对双黄连口服液活性成分收率的影响

现代研究证实，双黄连口服液主要药效成分除了黄芩苷、绿原酸、连翘苷外尚有黄芩素、木犀草素等多种活性成分，传统水醇法制备方法存在工艺成本较高、活性成分损失率高、操作周期长等缺点，通过试验测定结果可以看出，该试验通过创新应用专利酶解-物理除杂技术，运用复合酶高效、专性裂解细胞壁的特性并有机融合三级复合物理除杂工艺，使酶解法制备双黄连口服液6种主要活性成分收率较传统水醇法提升幅度在30%左右，其中，黄芩苷、绿原酸含量极显著高于常规提取工艺（P<0.01），连翘苷等其余成分也显著高于常规含量（P<0.05），能明显提升双黄连口服液产品品质。如表3所示。

3.2不同制备工艺对双黄连口服液药效作用的影响

3.2.1风热感冒治疗

从表4试验结果可以看出：酶解法双黄连样品配合治疗风热感冒防治效果优于水醇法样品和对照治疗组，这可能与生物酶法提取的双黄连所含黄芩苷、连翘苷、黄芩素、木犀草素等抗感染活性成分含量高，能够更有效的抑杀病毒、细菌等病原，提高机体免疫力及抗病能力，从而使机体抗病能力更强，治愈率更高，具体作用机制有待进一步研究。

表3　不同双黄连制备工艺有效成分含量比较　　单位：mg·ml-1

表4　各组防治风热感冒临床试验结果

3.2.2免疫应激引起的普通感冒预防

根据试验结果统计（详见表5），酶解法制备双黄连组防疫后第4天才有个别鸡只产生呼吸道症状，发生比率估测在2%以内，优于水醇法组（防疫后4天呼吸道症状发病率5%左右），空白对照组第2天即产生疫苗应激反应，发生比率在7%～10%之间，初步临床试验说明酶解法制备双黄连组效果优于水醇法。

表5　各组预防免疫应激性普通感冒临床试验结果

3.3小结

中药酶解提取技术是利用酶反应高度专一的酶来降解植物细胞壁，从而提高有效成分的溶出率，试验结果证明，通过生物酶解法提取口服液6种主要活性成分比传统水醇法活性成分收率要提高30%左右，二者具有显著差异。进一步通过临床对家禽风热感冒及免疫应激性普通感冒的试验比较，证实了酶解法提取的双黄连口服液临床治疗效果要明显优于水醇法双黄连口服液，且对风热感冒治愈率能够达到接近90%左右，具有一定的临床应用优势。同时，新工艺显著增加黄芩苷、绿原酸、木犀草素等抗感染活性成分提取率，上述结果说明，酶解法制备双黄连口服液可能是通过有效抗感染活性成分收率提升增加对风热感冒等治愈率。

4　讨论

现代药理学研究及临床实践证明，双黄连口服液中的黄芩具有清肺热、解肌表之热的功效，而金银花配合连翘具有辛凉解表之功效，其解热的机理就是作用于体温调节中枢，使机体产热量减少，体温下降；金银花活性成分能够抑制耐药菌蛋白质合成，阻断病原体的代谢和繁殖，从而抑制和杀灭病原微生物，黄芩苷具有抑制病毒复制的功能，从而阻断病毒的增殖，起到抗病毒的作用，连翘中的金丝桃素同样也具有抗病毒的作用，其抗病毒机制为阻断蛋白质和核酸的合成；大量研究证实，双黄连可促进溶血素的生成，对机体的免疫有增强作用，主要是增强T淋巴细胞的增殖，提高细胞免疫，此外还能够提高淋巴细胞的转化率，增强补体效价从而增强机体的免疫力。

免疫应激是非常复杂的生理反应，涉及到免疫、神经和内分泌等系统。一般认为机体主要通过下丘脑一垂体-肾上腺轴（HPA）系统参与调节应激反应，糖皮质激素是HPA轴的最终产物，由肾上腺皮质束状带分泌的主要有皮质酮、皮质醇等，对免疫系统具有广泛的作用。机体参与调节应激反应的途径除HPA轴外，还需要垂体-甲状腺系统参与。在免疫应激状态下，可能由于机体内肾上腺皮质激素和甲状腺素升高，使机体的细胞免疫功能受到抑制，机体更易受到外源感染威胁，引起感冒发热、咳嗽等病症。现代药理研究证实，双黄连所含苷元（黄芩黄酮、连翘酯苷）成分能够缓解家禽细胞及体液免疫抑制，激活补体系统，提升机体免疫力，这可能也是双黄连能够预防通风不良、忽冷忽热以及免疫应激等所致的普通感冒的作用机制之一。

双黄连口服液是目前市场认知度较高的兽用抗感染产品，其抗病毒、抗菌、解热抗炎方面多效药理作用的发挥有赖于主要活性成分最大限度被提取出来，该试验研究了新型酶解提取双黄连工艺，在这方面做了有益尝试，并在防治家禽感冒病症方面取得了理想的应用效果。□

王彬（1982-）男，临床兽医学硕士，从事中兽医药研究，hongyi2012@126.com。