MMPs、TIMPs及炎症因子在习惯性流产孕妇中的表达

马丹琦，梁丹，李爱金，杨丽珠，吕杰强

（1.温州医科大学附属第二医院 妇产科，浙江 温州 325027；2.台州市路桥区计划生育宣传技术指导站，浙江 台州 318050；3.台州恩泽医疗中心集团 妇产科，浙江 台州 318050；4.温州医科大学 药学院，浙江 温州 325035）

MMPs、TIMPs及炎症因子在习惯性流产孕妇中的表达

马丹琦1，2，梁丹3，李爱金3，杨丽珠4，吕杰强1

（1.温州医科大学附属第二医院 妇产科，浙江 温州 325027；2.台州市路桥区计划生育宣传技术指导站，浙江 台州 318050；3.台州恩泽医疗中心集团 妇产科，浙江 台州 318050；4.温州医科大学 药学院，浙江 温州 325035）

目的：探讨习惯性流产孕妇外周血和子宫内膜中基质金属蛋白酶（MMPs）、金属蛋白酶组织抑制剂（TIMPs）与氧化应激及炎症因子表达的意义。方法：收集2012年10月至2014年10月温州医科大学附属第二医院及台州恩泽医疗中心集团妇产科收治的习惯性流产孕妇32例为观察组，早孕人工流产孕妇35例为对照组。ELISA法测定外周血和子宫内膜中MMP-2、MMP-9、TIMP-2、TIMP-1及子宫内膜超氧化物歧化酶（SOD）、谷胱甘肽过氧化物酶（GSH-PX）、丙二醛（MDA）、白细胞介素-6（IL-6）、肿瘤坏死因子-α（TNF-α），并作相关性分析。结果：与对照组比，观察组血清MMP-2明显下降（P＜0.05），MMP-9、TIMP-2明显升高（P＜0.05），子宫内膜MMP-2、MMP-9明显下降（P＜0.01），TIMP-2明显升高（P＜0.05）；观察组子宫内膜SOD明显下降（P＜0.05），MDA、IL-6、TNF-α明显升高（P＜0.05）；观察组子宫内膜MMP-2、MMP-9与SOD、GSH-PX呈正相关，TIMP-2与MDA、TNF-α呈正相关。结论：MMPs/TIMPs系统的失平衡及炎症应激的异常表达可能与习惯性流产相关。

习惯性流产；基质金属蛋白酶；金属蛋白酶组织抑制剂；炎症；氧化应激

习惯性流产是妇产科常见妊娠并发症之一，传统观念认为习惯性流产发病与遗传、内分泌、子宫解剖异常、感染、免疫等因素有关［1-2］，但近年来的研究发现习惯性流产可能还和基质金属蛋白酶（matrix metallopr-oteinase，MMPs）及金属蛋白酶组织抑制剂（tissue inhibitor of metalloproteinase，TIMPs）有关［3-4］。如国外学者Anumba等［3］研究发现TIMP-2与习惯性流产相关，Konacl等［4］推测MMP-2、MMP-9、TIMP-1在子宫内膜中呈低表达而导致习惯性流产发生，提示了MMPs及TIMPs可能与习惯性流产相关。此外，有研究［5］报道炎症应激与MMPs的异常表达相关，而异常的炎症应激反应也可能导致流产的发生。本研究旨在探讨MMPs、TIMPs与氧化应激及炎症因子，包括子宫内膜超氧化物歧化酶（SOD）、谷胱甘肽过氧化物酶（GSH-PX）、丙二醛（MDA）、白细胞介素-6（IL-6）、肿瘤坏死因子-α（TNF-α）在习惯性流产孕妇和早孕流产孕妇外周血及流产组织中的表达情况，并进一步探究其内在的联系。

1　资料和方法

1.1一般资料 收集自2012年10月至2014年10月在温州医科大学附属第二医院及台州恩泽医疗中心集团妇产科收治的习惯性流产孕妇32例作为观察组，参照全国统编教材《妇产科学》［6］习惯性流产的诊断标准，排除先兆流产，排除有糖尿病、风湿、感染、肿瘤等基础疾病。入选病例在住院期间保胎失败，年龄22～34岁，平均（28.22±3.52）岁；体质量56～68 kg，平均（60.68±6.82）kg；孕周2～14周，平均（5.35±0.77）周；习惯性流产2～5次，平均（3.21±0.75）次。同时选择同期温州医科大学附属第二医院及台州恩泽医疗中心集团妇产科收治的35例早孕人工流产孕妇作为对照组，年龄21～ 34岁，平均（27.89±2.21）岁；体质量55～67 kg，平均（61.08±6.47）kg；孕周3～10周，平均（5.32± 0.69）周。2组一般资料比较差异无统计学意义（P＞0.05），具有可比性。

1.2检测指标和方法 流产后20 min内抽取静脉血10 mL 3 000 r/min离心10 min制备血清，保存于-60 ℃冰箱中待检，ELISA试剂盒法检测各组血清中MMP-2、MMP-9、TIMP-2、TIMP-1的含量，试剂盒购自武汉博士德生物工程公司，严格按照说明书进行操作。流产后当即取子宫内膜组织（包含绒毛）2 g，冰浴下洗净纱布吸干后置于冻存管内，于-70 ℃保存待测。临测时，4 ℃ 0.9%氯化钠溶液预冷，超声细胞粉碎仪下制成10%浓度组织匀浆，低温离心机3 000 r/min离心10 min取上清液，ELISA试剂盒法检测各组上清液中MMP-2、MMP-9、TIMP-2、TIMP-1的含量，试剂盒购自武汉博士德生物工程公司，严格按照说明书进行操作；ELISA试剂盒法检测SOD、GSH-PX、MDA，试剂盒购自南京建成生物公司；ELISA试剂盒法检测IL-6、TNF-α，试剂盒购自深圳晶美生物工程有限公司，操作严格按照说明书进行。

1.3统计学处理方法 采用SPSS16.0软件进行统计学分析。计量资料进行正态性检验，以±s表示，不同组间比较用独立样本t检验，相关性用Pearson相关分析。P＜0.05为差异有统计学意义。

2　结果

2.1各组外周血清MMP-2、MMP-9、TIMP-2、TIMP-1的含量 与对照组比较，观察组MMP-2明显下降（t= -2.216，P＜0.05），MMP-9明显升高（t=4.205，P＜0.01），TIMP-2明显升高（t=2.105，P＜0.05），TIMP-1 2组比较差异无统计学意义（P＞0.05）。见表1。

表1　各组外周血清MMP-2、MMP-9、TIMP-2、TIMP-1比较（±s，μg/L）

表1　各组外周血清MMP-2、MMP-9、TIMP-2、TIMP-1比较（±s，μg/L）

与对照组比：aP＜0.05，bP＜0.01

组别　n　MMP-2　MMP-9　TIMP-2　TIMP-1对照组　35　121.17±31.52a　141.41±41.37a　127.61±63.62a　139.28±51.82观察组　32　101.26±35.56a　184.22±39.79b　148.67±61.66a　142.25±48.98

2.2各组子宫内膜组织上清MMP-2、MMP-9、TIMP-2、TIMP-1的含量 与对照组比较，观察组子宫内膜组织上清MMP-2、MMP-9明显下降（分别t=-3.354、-3.676，P＜0.01）；TIMP-2明显升高（t=2.698，P＜0.05），TIMP-1 2组比较差异无统计学意义（P＞0.05）。见表2。

2.3各组子宫内膜组织上清氧化应激及炎症指标的含量 与对照组比较，观察组子宫内膜组织上清SOD明显下降（t=-2.149，P＜0.05），MDA、IL-6、TNF-α明显升高（分别t=2.632、3.174、6.083，P＜0.05或0.01），GSH-PX 2组比较差异无统计学意义（P＞0.05）。见表3。

表2　各组组织上清MMP-2、MMP-9、TIMP-2、TIMP-1比较（±s，μg/L）

表2　各组组织上清MMP-2、MMP-9、TIMP-2、TIMP-1比较（±s，μg/L）

与对照组比：aP＜0.05，bP＜0.01

组别　n　MMP-2　MMP-9　TIMP-2　TIMP-1对照组　35　152.68±46.21b　221.64±61.82b　125.21±57.87b　147.28±47.68观察组　32　86.27±35.32b　102.47±43.37b　168.66±69.61a　135.78±55.88

表3　各组组织上清氧化应激及炎症指标比较（±s）

表3　各组组织上清氧化应激及炎症指标比较（±s）

与对照组比：aP＜0.05，bP＜0.01

组别　n　SOD（U/mgprot）　GSH-PX（U/mgprot）　MDA（nmol/mgprot）　IL-6（pg/L）　TNF-α（pg/L）对照组　35　103.09±12.32a　62.29±10.45　63.71±6.18a　76.21±12.40a　207.54±58.81a观察组　32　96.30± 8.86a　58.00± 6.88　83.76±4.46a　90.28±16.42b　300.11±43.27b

2.4相关性分析 对子宫内膜组织上清MMPs、TIMPs与氧化应激及炎症指标作相关性分析发现，MMP-2 与SOD、GSH-PX呈正相关（r=0.376、0.356，P＜0.05），MMP-9与SOD、GSH-PX呈正相关（r=0.338、0.324，P ＜0.05），TIMP-2与MDA、TNF-α呈正相关（r=0.368、0.372，P＜0.05）。

3　讨论

习惯性流产是不孕不育研究领域的一大难点，其困扰了许多结婚不育家庭及临床医务工作者［7-8］。国外有学者认为其与子宫内膜组织结构异常和分子水平的紊乱相关，Anumba等［3］的研究显示MMPs/ TIMPs的异常表达和失平衡可能与习惯性流产的发生密切相关，而国内有关此方面的报道较少，我们期望通过以早孕人工流产孕妇作为对照，观察习惯性流产孕妇外周血清及子宫内膜组织MMPs、TIMPs与氧化应激及炎症指标表达的差异，来初步探讨其内在联系。

本研究发现，习惯性流产孕妇与早孕流产孕妇外周血、子宫内膜组织MMPs、TIMPs及氧化应激、炎症因子指标的表达存在差异，习惯性流产孕妇外周血清MMP-2明显下降，MMP-9、TIMP-2明显升高，这与国外Koucky等［9］对早产的研究结果相似，其异常表达可能与习惯性流产的发生相关。对子宫内膜组织上清中MMPs、TIMPs表达的研究发现，习惯性流产孕妇MMP-2、MMP-9明显下降，TIMP-2明显升高，这与Anumba等［3］、Konacl等［4］的研究结果相似，证实了子宫内膜MMPs/TIMPs的异常表达与失平衡参与了习惯性流产的发生，妊娠成功的关键是胚胎顺利植入子宫内膜，这个过程主要与滋养细胞对内膜的适度侵袭相关，尤其是对细胞外基质的降解，滋养细胞的侵入过程受自分泌和旁分泌的精确调控，多种细胞因子参与此过程，其中MMP-2、MMP-9的作用非常重要，MMP-2主要降解蜕膜组织而MMP-9主要降解胎膜明胶，MMPs对细胞外基质的降解是滋养细胞侵袭成功的关键，Fontana等［10］的研究证实MMP-2 及MMP-9的活性下降是妊娠失败的重要原因，此外，自然流产也可能与滋养细胞的异常生物学行为相关，MMPs的低表达导致滋养细胞浸润能力不足，螺旋小动脉无法转化为低阻力血管，胎盘局部缺血缺氧，最终导致流产的发生；对子宫内膜组织上清氧化应激及炎症因子指标的研究发现，习惯性流产孕妇SOD明显下降，MDA、IL-6、TNF-α明显升高，这提示了习惯性流产孕妇子宫局部存在氧化与抗氧化的失衡及炎症反应的异常激活；通过对MMPs、TIMPs与炎症应激指标作相关性分析发现，MMP-2的下降与SOD、GSH-PX呈相关，MMP-9下降与SOD呈正相关，TIMP-2的升高与MDA、TNF-α呈正相关，这提示两者协同参与了习惯性流产的发生。另外，Wang等［11］的研究发现，MMP-1抑制剂可阻断早产的发生，这为临床治疗习惯性流产提供了一个新的研究方向，提示可通过调整MMPs/TIMPs的表达来治疗习惯性流产。

综上，MMPs/TIMPs系统的异常表达和失平衡及炎症应激的异常激活可能与习惯性流产的发生密切相关。本研究不足之处是样本量太少，在今后工作中将继续积累病例进行观察研究。

［1］林其德. 免疫所致复发性流产和习惯性流产［J］. 中华妇产科杂志， 2000， 35（12）: 760-762.

［2］崔鲂， 孟江萍. 不明原因习惯性流产患者外周血Treg细胞和Th17细胞表达及其临床意义［J］. 中国医师杂志， 2014，16（1）: 35-41.

［3］Anumba DO， Gelany SE， Elliott SL， et al. Rcesieracrcuh lating levels of matrix proteases andtheir inhibitors in pregnantwomen with and without a history of recurrent pregnancy loss［J］. Reprod Biol Endocrinol， 2010， 8（1）: 62-70.

［4］Konacl E， Alp E， Onen HI， et al. Endometrial mRNA expression of matrix metalloproteinases， their tissue inhibitors and cell adhesion molecules in unexplained infertility and implantation failure patients［J］. Reprod Bio Med Onlin，2009， 19（3）: 391-397.

［5］刘文军， 梁灼萍， 陈祖尧， 等. 基质金属蛋白酶9和肿瘤坏死因子α表达与大鼠上下呼吸道炎性反应一致性研究［J］.中华耳鼻咽喉头颈外科杂志， 2011， 46（4）: 325-330.

［6］乐杰. 妇产科学［M］. 6版. 北京: 人民卫生出版社， 2004: 101-105.

［7］王英俊， 李大文， 张唯力， 等. 主要精液参数及精子DNA完整率与不明原因习惯性流产的相关性［J］. 中华医学遗传学杂志， 2012， 29（5）: 602-605.

［8］张先霞， 王繁. IVF-ET术后流产患者绒毛和蜕膜组织凋亡及相关调控蛋白的表达［J］. 温州医学院学报， 2012， 42（6）: 545-548.

［9］Koucky M， Germanova P， Mikolajczyk M， et al. Low maternal serum matrix metalloproteinase （MMP-2） concentrations are associated with preterm labor and fetal inflammatory response［J］. Perinat Med， 2010， 38（1）: 1-8.

［10］Fontana VA， Sanchez M， Cebral E， et al. Interferon-γinhibits metalloproteninase activity and cytotrophoblast cell migration［J］. Am J Reprod Immunol， 2010， 64（1）: 20-26.

［11］Wang W， Yen HT， Chen CH， et al. Prevention of inflammations associated preterm birth by knockdown of the endothelin-1［J］. Molecul Med， 2010， 10（1）:1-33.

（本文编辑：胡苗苗）

Expression of MMPs， TIMPs and inflammatory factors in habitual abortion cases

MA Danqi1，2， LIANG Dan3， LI Aijin3， YANG Lizhu4， LYU Jieqiang1.
1.Department of Obstetrics and Gynecology， the Second Affiliated Hospital of Wenzhou Medical University， Wenzhou， 325027； 2.Family Planning Publicity & Education Technical Advising Center of Luqiao， Taizhou， 318050； 3. Department of Obstetrics and Gynecology， Taizhou Grace Medical Center Group， Taizhou， 318050； 4.School of Pharmaceutical Sciences， Wenzhou Medical University， Wenzhou，325035

Objective: To investigate the expression of MMPs， TIMPs， Oxidative stress and inflammatory factors in serum and endometrial tissue of habitual abortion cases and to evaluate their clinical significance. Methods: From Oct. 2012 to Oct. 2014， 32 habitual abortion pregnant women were recruited as observed group，meanwhile 35 pregnancy abortion women were enrolled as control group. The expression of MMP-2， MMP-9， TIMP-2， TIMP-1 in serum and endometrial tissue were measured by ELISA. The expression of inflammatory factors in endometrial tissue including IL-6， TNF-α， MDA， SOD and GSH-PX were also detected by ELISA. Finally， the correlations of them were analyzed. Results: Compared to control group， the expression of MMP-2 in serum of observed group decreased obviously （P＜0.05）， MMP-9， TIMP-2 increased significantly （P＜0.05）； the expression of MMP-2 and MMP-9 of observed group in endometrial tissue declined obviously （P＜0.01）， while TIMP-2 improved remarkably （P＜0.05）； the expressions of MDA， IL-6， TNF-α of observed group in endometrium tissue were upregulated （P＜0.05）， but SOD was downregulated （P＜0.05）； in endometrial tissue of observed group， there were positive correlation between MMP-2， MMP-9 with SOD， GSH-PX， and between TIMP-2 with MDA， TNF-α. Conclusion: The imbalance of MMPs/TIMPs system and abnormal expression of inflammatory factors may be associated with habitual abortion.

habitual abortion； matrix metalloproteinase； tissue inhibitor of metalloproteinase； inflammatory；oxidative stress

R714.21

A DOI: 10.3969/j.issn.2095-9400.2015.11.004

2015-03-31

国家自然科学基金资助项目（31300819）；浙江省自然科学基金资助项目（LQ12B05004）。

马丹琦（1987-），女，浙江台州人，住院医师，在职硕士生。

吕杰强，教授，主任医师，博士生导师，Email：jieqianglu@126.com。