加味左金丸对大肠癌裸鼠ERK/MAPK信号通路的干预作用

胡丽娟

广东省中医院消化内科，广东 广州510006

加味左金丸对大肠癌裸鼠ERK/MAPK信号通路的干预作用

胡丽娟

广东省中医院消化内科，广东 广州510006

目的：探讨加味左金丸通过MAPK信号通路对人大肠癌裸鼠移植瘤的影响。方法：建立人大肠癌裸鼠皮下移植瘤模型，采用皮下注射HT29大肠癌细胞株制作大肠癌裸鼠模型。45只实验裸鼠随机分为3组：生理盐水组、加味左金丸高剂量组、加味左金丸低剂量组；观察不同组别对裸鼠致瘤的影响，动态观察各组裸鼠肿瘤体积变化，绘制肿瘤生长曲线。采用免疫印记法（Western blot）检测移植瘤ERK/MAPK活性及RT-PCT法检测组织ERK/MAPK mRNA的表达。结果：移植瘤接种成功率100%。裸鼠成瘤潜伏期一般3～5天，最长不超过7天。成瘤初表现为皮下黄白色结节，成瘤早期癌体基本成椭圆形，表面光滑，2周后逐渐增大为紫蓝色结节，边界清，略可活动，触之质中，逐渐不规则，表面凹凸不平，呈结节状。瘤体表面可见皮下有较多血管进入。裸鼠接种2周内，生理盐水组瘤体生长较快，加味左金丸各剂量组生长较慢。特别在后期，生理盐水组裸鼠显得尤为消瘦，拥挤少动，饮食方面各组差异不明显。当肿瘤直径达1cm以后，生长速度较慢，荷瘤鼠渐呈消瘦、精神萎靡、消瘦及恶病质衰竭状态发展。剖视肿瘤，大部分呈类圆形，个别形态不规则，色灰白，质硬。尸检未见腹腔脏器转移以及心、肝、脾、肺、肾、脑等重要脏器的损伤。加味左金丸各剂量组裸鼠皮下肿瘤组织生长较生理盐水组明显减慢（P＜0.05）。加味左金丸各剂量组组间比较，差异无显著性意义（P＞0.05）。加味左金丸各剂量组肿瘤组织ERK/MAPK相对活性明显较低（P＜0.05）。加味左金丸各剂量组组间比较，差异无显著性意义（P＞0.05）。结论：加味左金丸抑制人大肠癌裸鼠移植瘤的增殖，延缓肿瘤的生长，其机制之一可能是与抑制MAPK信号通路相关的ERK/MAPK的表达有关。

加味左金丸；裸鼠；移植瘤；ERK/MAPK信号通路

MAPK信号通路的失调出现在结直肠癌发展的早期，很多证据显示MAPK通路涉及结直肠癌的肿瘤侵袭和转移。笔者采用人大肠癌细胞株HT29裸小鼠皮下移植瘤模型，观察含黄连、吴茱萸等中药组成的加味左金丸对裸鼠移植瘤的作用，并初步揭示其作用机制，为临床更好应用中药抗肿瘤提供实验基础。

1 材料与方法

1.1 癌细胞株HT29 HT29培养于37℃、5%CO2浓度的培养箱中，培养液为含10%FBS的RPM I 1640。隔天更换培养液一次，每周传代1～2次，传代时用0.25%的胰酶消化处理和PBS洗涤。

1.2 药品与试剂 加味左金丸由黄连、吴茱萸、青黛组成，药物购自广东省中医院。中药煎煮过程：每次煎煮好一周剂量，先煮黄连和吴茱萸，用纱布滤出药液，装入大号研铂中，倒入青黛慢慢研磨，尽量使青黛慢慢溶入药液中，最后煎取所需药液量，放入4℃冰箱备用。

1.3 人大肠癌细胞株HT29裸小鼠移植瘤模型的制备HT29细胞生长至铺满培养瓶80%～90%，用0.25%的胰酶消化后收集，制成单细胞悬液，悬浮于生理盐水中。BALB/C裸鼠45只，饲养于广东省中医院科学研究中心无菌饲养间内（SPF级），裸鼠所用水、饲料、笼具一切器具均经高压蒸汽消毒法灭菌。

1.4 动物分组及处理BALB/C裸小鼠（购自广州维柏鑫生物科技有限公司，合格证号：1215708），4～6周龄，重量：18～22 g，45只，雌雄各半。观察裸鼠均健康，取肿瘤细胞悬液，于每只裸鼠左侧或右侧胁腹部皮下注射0.2m L，细胞量为2×106/只。将人大肠癌皮下移植的裸小鼠随机分为3组，尽量做到雌雄各半。①生理盐水组：15只，生理盐水0.5m L灌胃；②加味左金丸低剂量组：15只，以中药汤药0.67 g/kg灌胃，相当于60 kg成人用量；③加味左金丸高剂量组：15只，2 g/kg灌胃，相当于60 kg成人用量3倍。7天造模成功后，每组均连续灌胃1月。

1.5 抑瘤率 观察裸鼠成瘤时间，肿瘤生长特性。待肿瘤生长至15～75mm3时用于下一步实验。每组灌胃结束后，用游标卡尺测量每组裸鼠移植瘤的大小。抑瘤率=1-（加味左金丸各剂量组结束时平均体积-加味左金丸各剂量组开始时平均体积）/（生理盐水组结束时平均体积-生理盐水组开始时平均体积）×100%。

1.6 移植瘤ERK/MAPK活性 灌胃结束后的第2天，将裸鼠断颈处死，快速取下移植瘤体，放入液氮中保存，后转入-80℃冰箱中保存待测。细胞经实验因素处理后，离心收集。使用冰冷的PBS洗涤细胞3次，加入裂解缓冲液振荡混匀，冰浴30m in，4℃12000 rpm、离心半径10 cm离心10m in，取上清，即为胞质蛋白。使用BCA蛋白定量试剂盒进行蛋白定量。调整样品的蛋白量进行SDS—PAGE，将电泳分离的蛋白转移到PVDF膜上。PBST洗膜5m in。室温下用5%脱脂奶粉（PBST溶解）封闭PVDF膜1 h。随后加入抗ERK1/2或抗β-actin（1∶2000）4℃孵育过夜。PBST洗脱3次，加入相应的二抗，孵育1 h，漂洗3次。将PVDF膜用发光试剂ECL显色，暗室中曝光到X光片上，凝胶成像系统扫描分析结果。

1.7 移植瘤ERK/MAPK mRNA表达量 灌胃结束后的第2天，将裸鼠断颈处死，快速取下移植瘤体，放入液氮中保存，后转入-80℃冰箱中保存待测。RT-PCT法检测组织ERK/MAPK m RNA的表达。采用Trizol试剂（美国IBCO公司），参照说明对各组组织总RNA进行提取。取2μLRNA逆转录合成cDNA。反应条件：94℃预变性2m in后，94℃变性45 s、52℃退火45 s、72℃延伸1 min，35个循环，最后72℃延伸7m in。取3μL扩增产物用2%琼脂糖凝胶电泳，溴化乙锭（EB）显色，目的条带用图像分析系统作吸光度测定，以β-actin为内参照，ERK/MAPKm RNA与β-actin吸光度的比值作为ERK/MAPKm RNA的相对含量进行半定量分析，比较不同组ERK/MAPKm RNA表达的差异。ERKMAPKm RNA的引物序列按cDNA文库查获，引物由上海赛百胜生物技术公司合成。β-actin的引物序列：上游引物5-GGATCAGCA AGCAGGAGTATGA-3，下游引物5-CGCAAGTTAGGTTTTT GTCAAGAAAGGGT-3，扩增片段长度为116 bp。

2 结果

2.1 一般状况观察 见图1、图2、图3。移植瘤接种成功率100%。裸鼠成瘤潜伏期一般3～5天，最长不超过7天。成瘤初表现为皮下黄白色结节，成瘤早期癌体基本成椭圆形，表面光滑，2周后逐渐增大为紫蓝色结节，边界清，略可活动，触之质中，逐渐不规则，表面凹凸不平，呈结节状。瘤体表面可见皮下有较多血管进入。裸鼠接种2周内，生理盐水组瘤体生长较快，加味左金丸各剂量组生长较慢。特别在后期，生理盐水组裸鼠显得尤为消瘦，拥挤少动，饮食方面各组差异不明显。当肿瘤直径达1 cm以后，生长速度较慢，荷瘤鼠渐呈消瘦、精神萎靡、消瘦及恶病质衰竭状态发展。剖视肿瘤，大部分呈类圆形，个别形态不规则，色灰白，质硬。尸检未见腹腔脏器转移以及心、肝、脾、肺、肾、脑等重要脏器的损伤。

图1 2周加味左金丸低剂量组

图2 2周加味左金丸高剂量组

图3 2周生理盐水组

2.2 各组肿瘤生长抑制情况比较 见表1。加味左金丸各剂量组裸鼠皮下肿瘤组织生长较生理盐水组明显减慢（P＜0.05）。加味左金丸各剂量组组间比较，差异无统计学意义（P＞0.05）。

表1 各组肿瘤生长抑制情况比较±s）

表1 各组肿瘤生长抑制情况比较±s）

与同期生理盐水组比较，①P＜0.05；与同期加味左金丸高剂量组比较，②P＞0.05

组别加味左金丸低剂量组加味左金丸高剂量组生理盐水组n 15 15 15开始时（cm3）0.095±0.005 0.074±0.004 0.067±0.007用药第15天（cm3）0.512±0.074①②0.584±0.052①0.678±0.023结束时（cm3）0.741±0.065①②0.853±0.083①1.254±0.032抑瘤率（%）55.5 58.3

2.3 各组肿瘤组织ERK/MAPK相对活性比较 见表2。加味左金丸各剂量组肿瘤组织生长ERK/MAPK相对活性明显较低（P＜0.05）。加味左金丸各剂量组组间比较，差异无统计学意义（P＞0.05）。

表2 各组肿瘤组织ERK/MAPK相对活性比较?s）

表2 各组肿瘤组织ERK/MAPK相对活性比较?s）

与同期生理盐水组比较，①P＜0.05；与同期加味左金丸高剂量组比较，②P＞0.05

组别加味左金丸低剂量组加味左金丸高剂量组生理盐水组n 15 15 15吸光值0.195±0.045①②0.235±0.025①0.364±0.057

2.4 各组肿瘤组织ERK/MAPK mRNA表达量比较 见表3。加味左金丸各剂量组肿瘤组织生长ERK/MAPK相对活性明显较低（P＜0.05）。加味左金丸各剂量组组间比较，差异无统计学意义（P＞0.05）。

表3 各组肿瘤组织ERK/MAPKm RNA表达量比较±s）×106

表3 各组肿瘤组织ERK/MAPKm RNA表达量比较±s）×106

与同期生理盐水组比较，①P＜0.05；与同期加味左金丸高剂量组比较，②P＞0.05

组别加味左金丸低剂量组加味左金丸高剂量组生理盐水组n 15 15 15 ERK/MAPKmRNA表达量2.344±0.395①②2.613±0.103①4.045±0.200

3 讨论

近年来研究发现，MAPK信号传导通路是与肿瘤发生、发展、侵袭、转移有关的重要信号传导通路之一，MAPK信号传导通路及机制的阐明对于靶向干预相关疾病药物的研究具有重要意义，必将为恶性肿瘤等重大疾病的治疗提供新的思路［1］。虽然并行存在5条MAPK信号通路，其中ERK/MAPK途径是细胞增殖调节最主要的途径之一，该通路的活化在肠上皮细胞的分化中起了重要作用。ERK/MAPK信号通路的激活涉及结直肠癌的发病、进展和致瘤行为的证据越来越多［2］。ERK/MAPK途径所有的激酶可能都是治疗结直肠癌的有效靶点，现在许多研究小组在研制新的抑制剂。各条MAPK通路在结直肠癌中的精确作用成为研究热点。

加味左金丸为左金丸加青黛，青黛虽为后增药物，但在处方配伍关系中居臣药之位，黄连为君，青黛为臣，吴茱英为佐使。黄连性味苦寒，功效清热、解毒、燥湿；青黛性味苦寒，功效清热、解毒、泻火；吴茱英性味辛温，功效降逆止呕、散寒止痛。方中重用黄连入胃、大肠经以清热毒、祛湿热；青黛与之相须为用，更能增强君药之功效；少佐辛温之吴茱英以制君臣药之过于寒凉，并降逆止呕、止痛，以兼治恶心呕吐、疼痛之症状。在本研究中，加味左金丸低剂量组对裸鼠移植瘤大肠癌的抑瘤率与高剂量组比较，差异不明显；加味左金丸各剂量均能使ERK/MAPK的活性降低，抑制ERK/MAPK m RNA的表达，使大肠移植瘤的生长受到抑制。

既往研究表明，在离体的条件下，黄连小檗碱和吴茱萸碱可以诱导大肠癌HT29细胞的凋亡，对HT29细胞生长有明显的抑制作用，对HT29细胞端粒酶催化亚基（hTERT）表达有抑制作用［3～5］；1，2-DMH诱导大肠癌实验模型中，加味左金丸可以有效阻碍早期癌症的发生和发展；在DMH诱导大肠癌的过程中，加味左金丸可以很显著地干预癌症的发生，在癌症发展的进程中，加味左金丸可以有效地延缓癌症的进程［6］。

加味左金丸在本次试验中对裸鼠肿瘤组织大小及肿瘤相关因子有较好的抑制作用，提示中医药防治疗大肠具有一定优势，为中医药治疗大肠癌提供新的思路与方法，为加味左金丸的临床应用提供了新的实验依据，为大肠癌患者的中药防治、阻断癌前病变、改善预后和提高生活质量开辟了一条新途径，拓宽了中医药现代化研究的领域。

［1］季宇彬，胡哲清，邹翔.MAPK信号通路及其研究进展［J］.中国药理通讯，2010，27（2）：17-18.

［2］徐伟丽，孙文广，马莺.MAPK信号通路与结直肠癌［J］.现代肿瘤医学，2010，18（2）：389-392.

［3］谭宇蕙，陈冠林，郭淑杰，等.小檗碱对人胃癌MGC-803细胞生长抑制及诱导凋亡的作用［J］.中国药理学通报，2001，17：40-43.

［4］常金荣，文彬，王汝俊，等.吴茱萸碱和小檗碱对HT29细胞凋亡及端粒酶催化亚基（hTERT）表达的影响［J］.中药药理与临床，2008，24（2）：6-8.

［5］常金荣，文彬，王汝俊，等.吴茱萸碱和小檗碱对HT29细胞生长抑制和凋亡作用的影响［J］.中药新药与临床药理，2008，19（3）：191-195.

［6］文彬，熊曼利，戴伟怡.左金丸及反左金丸对实验性大肠癌不同时期甲基转移酶表达的影响［J］.世界华人消化杂志，2009，17（20）：2074-2078.

（责任编辑：骆欢欢）

R285.5

A

0256-7415（2015）02-0230-03

10.13457/j.cnki.jncm.2015.02.107

2014-09-11

广东省中医药局资助项目（20111209）

胡丽娟（1978-），女，副主任中医师，研究方向：中西医结合脾胃病学。