水稻OsCER4基因启动子序列及表达分析

林晓林等

摘要：通过生物信息学方法对水稻（Oryza sativa L.）蜡质合成相关基因OsCER4启动子序列和表达特性进行了分析；通过构建OsCER4启动子驱动的GUS融合表达载体，分析了OsCER4基因的时空表达；并分别以200 mmol/L NaCl、100 μmol/L ABA和1.0% H2O2处理水稻幼苗，通过半定量RT-PCR分析逆境胁迫下OsCER4的表达模式。启动子序列分析表明，OsCER4启动子中包括大量根、茎、叶肉等特异表达位点以及与干旱、冷、盐等多种逆境胁迫相关的调控序列。表达特征分析表明，OsCER4基因在愈伤组织、根、茎、叶中均有表达，在颖壳和子房中也有表达。NaCl和PEG等逆境胁迫下，OsCER4基因表达量在不同处理时间有所增加，H2O2胁迫下，OsCER4基因表达量有所下降。

关键词：水稻（Oryza sativa L.）；OsCER4基因；启动子；表达；逆境

中图分类号：Q78 文献标识码：A 文章编号：0439-8114（2015）18-4607-06

DOI：10.14088/j.cnki.issn0439-8114.2015.18.056

植物在生长发育过程中，常常会受到干旱、盐渍、低温、病虫害等非生物和生物胁迫因素的影响，其中，水分胁迫是环境胁迫中最普遍的逆境因子。干旱胁迫严重影响植物生长，增强植物抗旱性已成为植物育种的重要研究方向。在干旱逆境胁迫条件下，植物不仅可以通过细胞内的生理生化变化提高对干旱胁迫的耐性，如产生渗透调节物质脯氨酸以及增加抗氧化能力等。同时，植物还可以通过诱导干旱胁迫应答基因表达，产生大量特异蛋白，协同调节植物生理生化而适应外部逆境，提高对干旱的抗性。因此，剖析相关基因在植物逆境胁迫应答中的作用已成为植物分子生物学和作物抗旱研究的热点。

所有植物的地上部分表皮细胞外都覆盖着角质层，角质层由最外层的上表皮蜡质层和角质膜层组成，其主要功能是防止植物水分损失[1]，同时也是抵御外源物质渗入和微生物入侵的有效屏障[2]。多个与蜡质相关的基因已经在拟南芥（Arabidopsis thaliana）、水稻（Oryza sativa L.）等植物中被相继发现[3-10]，烷类合成相关的蜡质基因CER1在干旱胁迫条件下表达量显著增加[5]，而过表达CER1基因提高了植株抗逆性[6]。拟南芥角质层蜡质和角质合成的必需基因LACS1和LACS2发生突变增加了植株对干旱的敏感性[7]；水稻角质层蜡质合成相关基因OsGL1-1和OsGL1-2（又命名为WSL2）的突变导致植株叶表面蜡质明显减少，增加了植株干旱敏感性，而过表达OsGL1-1基因提高了植株对干旱的抗性[8-10]。过表达苜蓿中克隆的转录基因WXP1能增加表皮蜡质的积累，减少水分的丧失，增加抗旱能力[11]，转WXP1基因的拟南芥耐旱性同样增加[12]。OsCER4基因与拟南芥CER1基因，水稻OsGL1-1基因和OsGL1-2基因高度同源，属于脂肪醛脱羧酶（Fatty aldehyde decarbonylase）基因家族成员[13，14]。OsCER4基因（OsGL1-6）主要影响叶表面蜡质的合成，OsCER4基因（OsGL1-6）表达量的下降导致叶表面蜡质减少，干旱敏感性增加[15]。本研究通过生物信息学方法对水稻蜡质合成相关基因OsCER4（OsGL1-6）启动子序列和表达特性进行分析，同时，对逆境胁迫下OsCER4基因（OsGL1-6）的表达模式进行研究，为阐明OsCER4（OsGL1-6）基因在逆境胁迫下的分子作用机制奠定基础。

1 材料与方法

1.1 材料

1.1.1 植物材料 水稻（Oryza sativa L.）品种中花11，由华南农业大学遗传工程实验室提供。

1.1.2 载体与菌株 pCAMBIA1300G，以pCAMBIA1300与pBI221联合改建而成，在pCAMBIA1300的多克隆位点上插入了一段CaMV 35S启动子-GUS-终止子的序列，由华南农业大学遗传工程实验室提供；大肠杆菌菌株为DH10B；农杆菌菌株为EHA105，由华南农业大学遗传工程实验室保存。

1.1.3 试剂 RNA抽提试剂盒TRIzol 购自 Invitrogen公司；反转录酶（AMV RTase）、RNase inhibitor、Taq DNA聚合酶和dNTP等购自宝生物工程（大连）有限公司；氯仿、无水乙醇等为国产分析纯。

1.1.4 引物 OsCER4启动子扩增引物为OsCER4Gpr（5′-AAAAGGATCCTAGAGGCCATGATAGCTAGC-3′）和OsCER4Gpf （5′-AAAAAAG

CTTGGTTTGGAGATACAATCTGTG-3′）；OsActI扩增引物为OsActI-R（5′-TCTGGGTCATCTTCTCACGA-3′）和OsActI-F（5′-CGTCTGCGATAATGGAACTG-3′）；OsCER4扩增引物为OsCER4-R（5′-TCGTCGTATGGCCGGAATC-3′）和OsCER4-F（5′-GTCATGCAGTTACAGCAGCA-3′）。

1.2 方法

1.2.1 生物信息学分析 应用PLACE（http：//www.dna.affrc.go.jp/PLACE/）对启动子顺式调控元件进行预测；应用RIFGP（http：//plantbiol.genetics.ac.cn/rice-Affy）对OsCER4表达的组织器官特异性进行分析。

1.2.2 OsCER4启动子表达分析 以OsCER4Gpf、OsCER4Gpr为引物，以中花11基因组DNA为模板扩增蜡质合成相关基因OsCER4启动子片段，PCR扩增反应程序： 94 ℃预变性5 min；94 ℃变性30 s，55 ℃退火30 s，68 ℃延伸2 min，共7个循环；94 ℃变性30 s，65 ℃退火30 s，68 ℃延伸2 min，共28个循环；68 ℃延伸10 min。以OsCER4启动子片段替代载体pCAMBIA 1 300中的CaMV35S启动子，重新组装的载体采用农杆菌介导方法转入水稻中花11[16]。分别取转化水稻的愈伤组织、根、茎、叶、穗子等材料放于固定液（50 mmol/L磷酸缓冲液、1% 甲醛、0.5% Triton-100、pH 7.0）中，抽真空10 min，固定45 min；弃去固定液，加入适量洗液[50 mmol/L 磷酸缓冲液、0.5% Triton-100、1 mmol/L K3Fe（CN）6，1 mmol/L K4Fe（CN）6·3H2O、pH 7.0]，抽真空5 min，洗3次；弃去洗液，加入染色液[1 mmol/L磷酸缓冲液、0.5% Triton-100、0.25 mg/mL X-Gluc、1 mmol/L K3Fe（CN）6、1 mmol/L K4Fe（CN）6·3H2O、pH 7.0]，抽真空15 min，置于37 ℃反应过夜；样品以70%乙醇进行洗涤和保存，并在解剖镜下进行观察拍照。

1.2.3 逆境处理 参照Li等[17]方法进行，PEG、H2O2和NaCl的浓度分别为12%（M/V），1.0%（V/V），200 mmol/L。

1.2.4 RT-PCR分析 总RNA抽提参照李玲等[18]方法，逆转录反应参照Cristina等[19]方法。以OsActI为内参基因，以反转录得到的cDNA为模板，以OsCER4-R、OsCER4-F为引物进行PCR扩增，分析蜡质合成相关基因OsCER4的表达情况。PCR扩增反应体系：cDNA 1 μL、10×Buffer 2.5 μL、dNTPs（10 mmol/L）0.25 μL、上游引物（10 μmol/L）1 μL、下游引物（10 μmol/L）1 μL、Taq DNA聚合酶（5 U/μL）0.2 μL、ddH2O 19.05 μL。PCR扩增反应程序为：94 ℃预变性5 min；94 ℃变性30 s，58 ℃退火30 s，72 ℃延伸30 s，27个循环；72 ℃延伸10 min。

2 结果与分析

2.1 OsCER4基因启动子的反式作用元件分析

应用植物启动子及其反式元件分析在线数据库PLACE（http：//www.dna.affrc.go.jp/PLACE/signalup.html）对OsCER4启动子顺式作用元件进行了预测，结果见表1。结果表明，OsCER4启动子存在典型的TATA-box和启动子的基本元件CAAT-box以及大量的组织特异表达核苷酸位点：29个叶肉特异表达的CACTFTPPCA1位点，22个茎特异表达的位点DOFCOREZM和CCA1ATLHCB1，38个根特异表达位点ROOTMOTIFTAPOX1，RHERPATEXPA7，RYREPEATBNNAPA和RAV1AAT；4个花器发育相关元件MYBPLANT和NTBBF1ARROLB。OsCER4启动子也包括大量的与逆境相关的顺式作用元件：早期应答脱水胁迫和ABA应答有关的顺式作用元件ACGTABREMOTIFA2OSEM、ABRELATERD1、

ACGTATERD1、ANAERO1CONSENSUS、MYB1AT、MYBCORE、DPBFCOREDCDC3、CATATGGMSAUR、GADOWNAT、MYB1AT、MYCATRD22、MYCATERD1和WRKY71OS以及响应高盐、冷、伤害、病原菌等生物和非生物胁迫的顺式元件GT1GMSCAM4、MYCCONSENSUSAT、BIHD1OS、MYBPZM、RAV1AA

T、OSE2ROOTNODULE、WBBOXPCWRKY1、MYBST

1、ELRECOREPCRP1和WBOXNTERF3等；还有响应Ca2+信号、氧化胁迫以及铜离子胁迫相关的顺式作用元件CURECORECR和ABRERATCAL。同时，还存在外源激素信号分子生长素、细胞分裂素、水杨酸相关顺式作用元件SURECOREATSULTR11、ARR1AT、CPBCSPOR、WBOXATNPR1和ASF1MOT

IFCAMV等。除了胁迫相关顺式作用元件，还发现与储藏蛋白质表达相关的调控元件2SSEEDPROTBANAPA和SEF4MOTIFGM7S；光诱导顺式作用元件GATABOX、REALPHALGLHCB21和IBOXCORE/SORLIP1AT以及糖应答元件CGACGOSAMY3、WBOXHVISO1、YRIMIDINEBOXOSRAMY1A、TATC

CAYMOTIFOSRAMY3D和MYBGAHV等。通过启动子顺式元件网站的分析预测，水稻蜡质合成相关基因OsCER4启动子具有叶、根、茎等组织特异表达的特性，且存在多个响应生物和非生物逆境胁迫的元件。

2.2 OsCER4基因的表达分析

通过水稻基因组芯片表达数据库（http：//plantbiol.genetics.ac.cn/rice-Affy）分析表明，OsCER4基因主要在幼苗叶、幼苗、子房和胚中表达，OsCER4基因可能在叶或种子发育中起作用（表2）。

2.3 OsCER4启动子的表达分析

从中花11基因组中用引物OsCER4Gpr和OsCER4Gpf扩增OsCER4基因的启动子OsCER4P。结果表明，获得与预期大小一致的1 946 bp特异片段（图1a）。用Hind Ⅲ和BamHⅠ双酶切将OsCER4P启动子片段克隆到pCAMBIA1300G载体中，用OsCER4基因的启动子CER4P替代载体中的35S启动子，然后抽提质粒DNA进行酶切鉴定，结果如图1b所示。将质粒DNA酶切鉴定的菌液送至Invitrogen公司测序，测序正确的菌株抽取质粒转化农杆菌。同时，本研究通过对农杆菌的GUS染色来鉴定启动子启动GUS活性表达的能力以及进一步确认农杆菌的阳性克隆。结果（图1c）表明，启动子具有启动GUS活性表达的能力。通过农杆菌介导法将OsCER4P：：GUS载体转化水稻，转化植株经阳性植株鉴定之后，取其愈伤组织、根、茎、叶及小穗进行GUS染色，通过GUS组织化学染色方法来分析OsCER4基因启动子表达的特异性。GUS染色分析表明，在愈伤组织、根、茎、叶中均能检测到GUS活性（图2）。在颖壳和子房中也有GUS活性表达，说明OsCER4的表达有组织特异性，可能与营养器官和种子的发育有关。

2.4 逆境胁迫下OsCER4的表达分析

为考察水稻蜡质合成相关基因OsCER4对逆境的响应，本研究采用半定量RT-PCR的方法分析不同逆境处理下幼苗中OsCER4表达变化。结果（图3）表明，NaCl处理下对OsCER4而言，在处理6 h之内，其表达量下降，当处理时间达12 h时，表达量有所增加；PEG处理下，OsCER4表达量在处理30 min 后开始有所增加，并维持在较高水平，36 h时略有下降；H2O2处理下，OsCER4表达量在处理30 min 时变化不明显，3 h时表达量开始下降。

3 小结与讨论

植物基因启动子控制着基因在特定的组织、特定的发育阶段以及一定的环境条件下表达。基因所表现的时空特异性受到该基因启动子区域内各种顺式作用元件与不同反式作用因子之间相互作用的协调控制。启动子序列分析表明，OsCER4基因启动子具有启动子常有的相应调控元件以及下游组织特异性表达必需的核苷酸序列，包括TATA-box、CAAT-box等。启动子还含有大量的组织特异表达顺式作用元件：叶肉、茎、根、花器发育（MYBPLANT）以及微管组织发育（NTBBF1ARROLB）相关的特异顺式表达元件，说明OsCER4基因可能与营养器官和微管组织以及种子的发育有关。通过水稻基因组芯片表达数据库分析表明，OsCER4基因在幼苗、幼叶、子房和胚中表达量较高。而OsCER4启动子驱动的GUS融合表达分析表明，OsCER4基因启动子在根、茎、叶、叶枕、颖壳、子房等均有表达活性，在花药中几乎没有表达活性，进一步说明OsCER4基因可能与营养器官和种子的发育有关。在对OsCER4基因（OsGL1-6）的前期研究中发现，OsCER4基因表达部位集中于维管束区域[15]，这一结果与本研究对启动子区域的组织特异表达顺式作用元件分析一致。说明OsCER4基因启动子序列上一系列的顺式元件决定了其组织器官的表达。

植物组织特异表达的启动子中存在着不同的结构域，通过这些结构域的协同作用调节着启动子不同的表达模式。OsCER4基因启动子序列中还有大量干旱、高盐、病原菌、冷等逆境胁迫应答相关顺式作用元件，说明OsCER4基因启动子调控的下游基因与植物逆境应答反应相关。本研究应用RT-PCR技术研究该基因在PEG、高盐和H2O2等处理下的表达模式，结果表明，在高盐和干旱处理条件下，OsCER4基因表达量均有所上调。植物表皮蜡质层在植物生长发育、适应外界环境方面具有重要作用，植物表皮蜡质层的增加常常受环境逆境的诱导。玉米、拟南芥等植物蜡质合成中的关键基因在mRNA水平上的表达受干旱、盐逆境处理调节[20]。拟南芥在150 mmol/L NaCl处理下叶蜡质总量增加[5]。水稻幼苗在NaCl、H2O2、ABA等逆境胁迫下，OsGL1-5基因表达均受到诱导[20]。逆境处理诱导蜡质合成相关基因的表达以及增加蜡质的积累可能是植物适应环境的一种机制。蜡质合成相关基因在不同逆境处理下诱导表达的情况不一样，本试验发现H2O2处理下，OsCER4基因表达量下降，而在分析OsGL1-5基因的逆境响应时发现其在H2O2处理下的表达量增加[21]。高国赋等[22]的研究也发现不同蜡质合成相关基因对不同胁迫响应存在差异，前期研究高温和低温对蜡质基因表达的影响时也有同样发现[16]。

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