茶叶生产废料中表没食子儿茶素没食子酸酯的纯化工艺

许敏等

摘要：分析了茶叶生产废料中表没食子儿茶素没食子酸酯（EGCG）的纯化工艺，并采用大孔树脂对其进行分离纯化。结果表明，运用静态吸附与动态吸附相结合的方法分析得到，适用于茶叶生产废料中EGCG分离纯化用的大孔吸附树脂为D101。其最佳分离纯化条件为：将20.0 mg/mL上柱液以1.5 BV/h上柱4.5 BV，使用20%乙醇以0.5 BV/h洗脱4.0 BV。

关键词：茶叶生产废料；表没食子儿茶素没食子酸酯（EGCG）；纯化

中图分类号：S571.1；TS272.2 文献标识码：A 文章编号：0439-8114（2015）18-4570-03

DOI：10.14088/j.cnki.issn0439-8114.2015.18.045

茶叶是恩施土家族苗族自治州的六大经济支柱产业之一，在其生产过程中会产生大量的废料——茶梗、茶末、茶树修剪枝条等。这些废料因含有表没食子儿茶素没食子酸酯（以下简称EGCG）而极具开发价值[1]。据文献报道，EGCG具有抗肿瘤、抗动脉粥样硬化、抗氧化、免疫调节、对糖尿病肾脏的保护、防辐射等作用，还可以降压、降脂、降血糖[2-7]。为了综合开发茶叶资源，促进恩施州茶叶产业链的有效延伸，增加当地茶农的收入，采用当地产量大、价格低廉的茶叶生产废料提取EGCG，并对其提取工艺进行研究，以期更有效地开发利用茶叶废料。

1 材料与方法

1.1 材料与试剂

茶叶生产废料购于恩施市清江生物有限公司。大孔树脂：D608、 HPD100、 XDA-1、 D302、 D101B、D609、D103、D102、D4020、DM130、D101、D301、X-5及聚酰胺型树脂（上海摩速科学器材有限公司）。

EGCG标准品（批号：100603，含量≥98%，上海融禾医药科技有限公司提供）；水为纯化水；甲醇、乙腈为色谱纯，其他试剂为分析纯。

1.2 仪器

DIONEX U3000 高效液相色谱仪（Chromeleon色谱工作站），Acclaim 120 C18 5 μm Analytical （4.6 mm×250 mm）色谱柱，VWD3100检测器； MS105 半微量天平（感量0.01 mg，METTLER TOLEDO）；AL204 分析天平（感量0.1 mg，METTLER TOLEDO）；LGJ-10冻干机（北京四环科学仪器厂）；KQ-2500超声波清洗仪（昆山市超声仪器有限公司，33 kHz）；UV2600紫外可见分光光度计（上海天美科学仪器有限公司）；微孔滤膜（有机系，0.22 μm）。

1.3 方法

1.3.1 标准曲线绘制 精密称取EGCG标准品适量，置于棕色量瓶中，加甲醇溶解制成浓度为0.3 mg/mL的溶液，摇匀，微孔滤膜过滤，取滤液作为标准品溶液。取5、10、15、20、25 μL标准品溶液参照文献[8]的色谱条件分别测定峰面积，平行测定3次。以进样量X（μg）为横坐标轴、峰面积A为纵坐标轴绘制标准曲线，计算其线性回归方程。

1.3.2 EGCG测定方法 称取茶叶生产废料细粉0.2 g，置于10 mL棕色量瓶中，加甲醇超声提取30 min，放冷，用甲醇稀释至刻度，摇匀，微孔滤膜过滤，取滤液测定峰面积并带入回归方程计算茶叶生产废料中EGCG的含量。

1.3.3 EGCG提取方法 取茶叶生产废料粗粉10 g置于索氏提取器中，参照文献[9]的方法提取2次，趁热抽滤，合并滤液，减压浓缩至无乙醇味，得茶叶生产废料提取液。

1.3.4 EGCG纯化工艺

1）树脂的筛选。对大孔树脂进行预处理[10，11]，分别量取预处理好的大孔树脂10 mL，置250 mL具塞锥形瓶中，加入100 mL已知EGCG浓度的茶叶生产废料提取液，25 ℃、100 r/min振荡24 h后取出，测定EGCG吸附量，并计算比吸附量（比吸附量=EGCG吸附量/树脂体积）；静态吸附完成后，过滤除去茶叶生产废料提取液，将树脂重新置于250 mL具塞锥形瓶中，加入100 mL 95%乙醇以25 ℃、100 r/min振荡24 h取出，测定EGCG解吸量，计算解析率（解析率=被解析EGCG量/被吸附EGCG量×100%）。选择比吸附量大且解析率高的大孔树脂作为分离纯化EGCG的树脂。

2）吸附条件优化。改变样品的浓度、上样速度对吸附条件进行优化[10，11]。分别取60 mL筛选出的树脂装入3根玻璃柱，充分沉降均匀，将样品溶液以一定速度通过树脂柱，前150 mL流出液不收集，后每15 mL收集1份，分别取5 μL测定EGCG峰面积，绘制曲线图，确定上样浓度及上样速度。根据确定的上样浓度和上样速度进行动态吸附，并测定EGCG峰面积，绘制泄露曲线。

3）洗脱条件优化。改变乙醇的体积分数、洗脱流速对洗脱条件进行优化[10，11]。按上述确定的吸附条件上柱，吸附平衡后，用2 BV纯化水淋洗树脂柱，后依次用不同体积分数的乙醇溶液以不同的流速淋洗树脂柱，各浓度淋洗液的量为3 BV。收集淋洗液，每15 mL收集1份，每份淋洗液取5 μL进行液相色谱仪分析，测定EGCG峰面积，绘制洗脱曲线，考察乙醇体积分数、洗脱流速对洗脱效果的影响。

2 结果与分析

2.1 标准曲线

线性回归方程为：A=22.733X-0.5571，r=0.999 8（n=5）。

2.2 含量测定

采用HPLC分析得到茶叶生产废料中EGCG的含量为82.42 mg/g。

2.3 树脂的筛选

在筛选的14种树脂中，多种大孔树脂对茶叶生产废料中EGCG的比吸附量都较大，但以D101型树脂为好，从解析率来看，也以D101型树脂为最好，故确定D101型树脂为分离纯化茶叶生产废料提取液中EGCG的最佳树脂。

2.4 吸附条件优化

2.4.1 上样浓度 不同上样浓度的曲线见图1。从图1可以看出，上样浓度对单位树脂吸附EGCG的量影响不大，但对吸附时间有比较大的影响。在试验过程中发现，当上样浓度超过20 mg/mL以后，样品溶液在上柱过程中易产生沉淀，堵塞树脂柱，故最终确定上样浓度为20 mg/mL。

2.4.2 上样速度 上柱流速为1.0、1.5、2.0 BV/h，当漏出液EGCG峰面积达拐点时，其上柱液体积分别为4.5、4.5、4.2 BV，上柱操作时间分别为270、180、126 min。从试验过程来看，1.5 BV/h比1.0 BV/h的上样速度要快得多，但树脂吸附EGCG总量却没有差异，故确定上柱流速为1.5 BV/h。

2.4.3 泄露曲线 泄露曲线见图2。从图2可以看出，从第18号收集液开始，EGCG的峰面积急剧增大，说明此时EGCG已经开始明显泄露，故确定茶叶生产废料提取物溶液的上柱量为4.5 BV。

2.5 洗脱条件优化

2.5.1 乙醇体积分数 当采用10%的乙醇洗脱时，EGCG很快就被洗脱下来，表儿茶素没食子酸酯（以下简称ECG）却没有洗脱出来，随着时间的推移，EGCG和ECG相伴洗出；当乙醇达到20%时，EGCG和ECG的洗脱速率明显变快。但是当乙醇达到30%时，洗脱液中的杂质种类明显增多，故选择20%乙醇作为洗脱剂。

2.5.2 洗脱流速 不同洗脱速度的洗脱效果见图3。从图3可以看出，当采用0.5 BV/h的洗脱速度进行洗脱时洗脱效果较好。

2.5.3 洗脱曲线 洗脱曲线见图4。由图4可以看出，从第15份洗脱液开始EGCG峰面积值很小，到第17份时已基本为零，表明此时大孔吸附树脂吸附的EGCG已基本完全洗脱，故确定洗脱剂用量为4.0 BV。

3 小结与讨论

运用静态吸附与动态吸附相结合的方法找到适用于茶叶生产废料提取物中EGCG分离纯化用的大孔吸附树脂为D101。其最佳分离纯化条件为：将20.0 mg/mL上柱液以1.5 BV/h上柱4.5 BV，使用20%乙醇以0.5 BV/h洗脱4.0 BV。

从茶叶生产废料中提取、分离纯化EGCG的全过程均采用对设备和环境友好的乙醇水溶液作为溶剂，其兼容性及连续性增强，溶剂回收方便，能耗降低，生产周期缩短，且乙醇廉价无毒，对环境没有污染，生产企业对“三废”的处理成本也会大大降低，有利于企业大规模生产。

本研究从茶叶生产废料中提取分离纯化生产高附加值的EGCG，是茶叶产业链很好的延伸，与恩施州的产业链建设政策高度契合，且有利于充分利用恩施州的茶叶资源，变废为宝，提高茶农的收入，为恩施州茶叶产业链的建设注入新的活力。

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