四川裂腹鱼同工酶研究

摘要：采用聚丙烯酰胺凝胶电泳法，对四川裂腹鱼（Schizothorax kozlovi Nikolsky）的眼球、心脏、肾脏、性腺、脾脏、肝脏、脑、鳃和肌肉9种组织中的乳酸脱氢酶同工酶、苹果酸脱氢酶同工酶、谷氨酸脱氢酶同工酶、乙醇脱氢酶同工酶、酯酶同工酶5种同工酶进行了测定。结果表明，5种同工酶在四川裂腹鱼9种组织均有表达，且具有明显的组织特异性。

关键词：四川裂腹鱼（Schizothorax kozlovi Nikolsky）；乳酸脱氢酶；苹果酸脱氢酶；谷氨酸脱氢酶；乙醇脱氢酶；酯酶

中图分类号：S917.4 文献标识码：A 文章编号：0439-8114（2015）18-4540-04

DOI：10.14088/j.cnki.issn0439-8114.2015.18.037

同工酶是一类不同基因位点或等位基因表达的产物，同工酶变异比较丰富且能稳定遗传，广泛应用于种质资源评价及鱼类群体遗传学研究中。同工酶技术试验方法规范、简便和快速，具有可以大量检测分散于整个基因组中各基因座位等位基因间表型变异的特点，且不需要特殊的仪器设备，花费相对低廉，数据处理的方法也已被认可，是一种较好的种质资源检测方法[1]。鱼类同工酶的研究已报道的主要有：姜建国等[2]对青鱼（Mylopharyngodon piceus）不同组织中同工酶的表达模式的研究；张伟[3]对鄱阳湖泥鳅（Misgurnus anguillicaudatus）细胞遗传与繁殖生物学的研究；马波等[4]对兴凯湖翘嘴红鲌（Erythroculter ilishaeformis）的肌、肝、眼、心4种组织的8种同工酶（LDH、EST、MDH、IDH、SOD、ME、G-6-PDH、ADH）的研究；唐文家[5]对黄河裸裂尻鱼[Schizopygopsis pylzovi Kessler （Kess-ler）.]乳酸脱氢酶同工酶的研究；王金秋等[6]对松江鲈鱼（Trachidermus fasciatus）不同组织同工酶的研究；全成干等[7]对大黄鱼（Larimichthys crocea）养殖群体遗传多样性的同工酶的研究；朱必凤等[8]对鄱阳湖鳜鱼（Siniperca chuatsi）、团头鲂（Megalobrama amblycephala）肌肉4种同工酶的研究；吴瑯虎等[9]对高背银鲫（Silver prussian carp）、大口胭脂鱼（Ictiobus cyprinellus）及胭脂鲫（F1）不同组织的同工酶的表型的分析；吴兴兵[10]对江苏水域7种重要养殖鱼类的同工酶和ISSR的分析；段彪等[11]对细鳞裂腹鱼[Schizothorax chongi（Fang）]同工酶组织特异性的研究；胡思玉等[12]对昆明裂腹鱼（Schizothorax grahami）同工酶组织特异性的研究；刘鸿艳等[13]鱼类同工酶的应用及研究进展等。对四川裂腹鱼（Schizothorax kozlovi Nikolsky）同工酶的研究，仅见安苗等[14]对其4种组织5种同工酶的研究的报道。因此，本研究对四川裂腹鱼9种组织中5种同工酶进行了研究，并与其他鱼类同工酶进行了比较，评价其种质特性。

1 材料与方法

1.1 材料

试验用四川裂腹鱼标本采自乌江上游总稽河，运回实验室饲养1周以上。试验时在冰盘中进行常规测量，解剖取眼球、肌肉、心脏、性腺、肝脏、鳃、脾脏、肾脏和大脑9种组织。先用0.1 mol/L磷酸钠缓冲液（pH 7.0）洗净、吸去水分后取适量称重，以样品∶缓冲液=1∶3（W∶V）的比例混合，匀浆后于4 ℃下15 000 r/min 离心30 min，然后取上清液作电泳分析。

1.2 方法

采用聚丙烯酰胺作电泳支持物，电泳槽为DYCZ-24D型。电泳参考卢龙斗等[15]介绍的方法进行，浓缩胶占5%，分离胶占10%，电极缓冲液为Tris-Gly溶液（pH 8.3）。进样量45～55 μL，指示剂为溴酚兰，在4 ℃下进行电泳，染色方法参照卢龙斗等[15]、何忠效等[16]和吴兴兵[10]的方法并略加改进，染色完毕后用TANON GIS1000凝胶图像分析系统进行拍照及结果分析，同工酶的命名以向阳极方向泳动最快的编为1号，以下各酶分别编为2、3、4等号。

2 结果与分析

2.1 酯酶（EST）

鱼类酯酶的多态现象非常普遍，酶谱表现复杂。四川裂腹鱼EST同工酶的酶谱表现较为复杂，在9种组织中均有表现，各组织中的酶活性均较强，只有肌肉稍弱。9种组织共检测到7条酶带（图1），其中EST1仅在脑中检出，EST2、EST3仅在肝脏中检出，分布较广的是EST5、EST6、EST7，在9种组织中均检出。

同工酶酶谱可明显分为3个区域（图1），推测至少由3个基因位点编码，各组织间特异性小，9 种组织均具有EST5、EST6、EST7。EST1仅见于脑，且活性非常弱；EST2、EST3仅见于肝脏，可能与肝脏的解毒作用有关；EST4存在除了性腺和脾脏外的其他7种组织。从EST5、EST6、EST7的活性强度看，EST5在鳃中表现活性最强，EST6、EST7在肝脏中表现活性最强。

2.2 乳酸脱氢酶（LDH）

乳酸脱氢酶（LDH）是参与糖酵解的关键酶，现已知大多数脊椎动物的LDH同工酶由A、B、C 3个位点决定，通常C位点具有组织的差异，其编码的蛋白质电荷与A、B不同。本试验中共检测出约17条酶带（图2），并具有明显的组织特异性，表明四川裂腹鱼LDH同工酶至少由A、B、C 3个位点控制。LDH5、LDH9、LDH11、LDH14、LDH17等酶仅在肝脏中检出，LHD8仅在眼球中检出，LHD15仅在脑中检出，LDH2仅在眼球和肌肉中检出，LDH13仅在性腺和鳃中检出。肝脏中检出的6种酶，除LDH1在心脏、肾脏、脾脏检出外，剩下的均未出现在其他组织中。活性最强为心脏中LDH10，最弱的是LDH1在肝脏中的表现。

2.3 苹果酸脱氢酶（MDH）

苹果酸脱氢酶（MDH）存在有相互不形成异聚体的线粒体型（m-MDH）和上清液型（s-MDH）两部分，均是两个基因编码的二聚体。四川裂腹鱼苹果酸脱氢酶也有线粒体型（m-MDH）和上清液型（s-MDH）两种类型（图3），且具有明显的组织特异性。线粒体型（m-MDH）的MDH7、MDH8、MDH9仅在脾脏、脑和肌肉中检出，其中MDH8、MDH9仅在肌肉中检出，MDH3仅在脑组织中检出，MDH6仅在肝脏中检出，MDH1、MDH8、MDH9仅在肌肉中检出。9种组织共检测到9条酶带，多于理论上二聚体两基因编码最多形成3条酶带，可能与m-MDH也存在基因编码后的化学修饰有关，也有可能与四川裂腹鱼的染色体多倍性相关。

2.4 谷氨酸脱氢酶（GDH）

谷氨酸脱氢酶为两个位点编码的二聚体，四川裂腹鱼9种组织共检测出13条酶带（图4），具有明显的组织特异性。其中GDH1仅在肝脏中检出，GDH10仅在鳃组织中检出，GDH4仅存在性腺和脾脏组织中，GDH6仅存在于脑和肌肉组织中。谷氨酸脱氢酶在心脏和眼球组织中表达较为充分，活性较强，在肝脏、脾脏和性腺等组织中较弱。

2.5 乙醇脱氢酶（ADH）

乙醇脱氢酶为两个位点编码的二聚体，四川裂腹鱼9种组织共检测到12条酶带，酶谱特征较为一致，活性较强，但表现出明显的组织特异性（图5）。肝脏中有特异带ADH1，脾中有特异带ADH6，脑中有特异带ADH10。肝脏中ADH1的活性强于其他组织中的活性，可能与肝脏的解毒作用有关。ADH2仅在心脏和肾脏检出，ADH5仅在眼球和脾脏中检出。ADH12分布较为广泛，分布在除眼球外的所有组织中，其次是ADH11和ADH4。酶活性最强的组织是眼球和心脏，最弱的是脾脏。

3 小结与讨论

朱蓝菲等[17]对20种鲤科鱼类的LDH同工酶进行了比较研究，发现LDH在鲤科鱼类进化中已分成两种主要支系，一支起源于雅罗鱼亚科，表现出A基因的保守性，其特点为LDH-B4同工酶的迁移率不断变慢，直到与LDH-Aa同工酶接近；另一支起源于鲴亚科，表现出B基因的保守性，其特点是LDH同工酶的迁移率不断加快，直到与LDH-B4同工酶接近。唐文家[5]对黄河裸裂尻鱼的酶谱经过比较研究，LDH-A基因和LDH-B基因保守性较差，两种基因在黄河裸裂尻鱼都有表达。

裂腹鱼亚科鱼类是原始鲃类长期适应高原特殊环境而产生的一个自然类群，陈毅峰[18]曾推测该亚科鱼类应当是四倍体起源的鱼类，在其演化中涉及了多倍体甚至多次多倍体过程。本研究中四川裂腹鱼5种同工酶的基因位点、酶活性及同工酶类型都存在不同程度的组织特异性，与同为四倍体类型的黄河裸裂尻鱼相似。其中，EST的位点和酶带数目在历次研究中起伏较大，除与试验材料（鱼的年龄、发育阶段、生活环境、生理状态、样本采集与保存等）和试验方法（电泳支持物、缓冲系统、电泳条件等）有关外，推测可能还与EST本身比较复杂且弱带显带不稳定有关。9种组织都有LDH同工酶，但活性有差异，且C基因只位于肝脏中，因而LDH4、LDH7、LDH9、LDH11、LDH13只在肝脏中表现。此外，在眼球和肌肉中还可能存在一些特殊的基因，LDH2仅在这两种组织中得到表现。MDH在9种组织的分子类型完全不同，酶活性也不完全相同，除脑以外其他组织中都有m-MDH，且活性比较强。GDH和ADH仅在肝脏和肌肉中检测到活性，而本研究中在几种组织中均检测到其活性，与胡思玉等[12]的研究结果一致，表明它们同属鱼体组织普遍表达的酶带，这些酶可用于遗传资源的评估。

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