树莓叶果黄酮类化合物含量及抗氧化性分析

杨国慧等

摘要：以树莓（Rubus idaeus L.）品种美国22、欧洲红、金秋、黑树莓为试材，于2013年5～8月采集结果枝和根蘖苗中部叶片、青果、熟果，利用超声波法和 NaNO2-Al（NO3）3比色法测定黄酮类化合物含量。结果表明，4个品种叶片的黄酮类化合物含量均在6月末最高，欧洲红和美国22结果枝叶片的高于根蘖苗叶片；青果高于熟果，品种间的含量高低为金秋、美国22、欧洲红、黑树莓，同一品种叶片的黄酮类化合物含量高于果实。叶片的黄酮类化合物对4种自由基（·OH、O2-·、ABTS·、DPPH·）的清除能力均在6月末最强，青果高于熟果和叶片，青果中金秋的清除能力最强。

关键词：树莓（Rubus idaeus L.）；叶片；果实；黄酮类化合物；抗氧化性

中图分类号：S663.2；Q944.5；Q946.83 文献标识码：A 文章编号：0439-8114（2015）18-4514-05

树莓（Rubus idaeus L.）为适合在寒地栽培的一种特色小浆果类果树，据报道，树莓的叶片与果实中均富含黄酮类化合物[1]。目前关于树莓黄酮类化合物的研究所采用的试验材料其果实主要以红树莓为主，而叶片则采用成熟叶片。树莓果实除红色果之外，还有紫、黄、黑色果等类型；而叶片颜色在一年的生长期里会呈现出季节性的动态变化。树莓不同颜色的果实、不同季节的叶片、叶片和果实之间黄酮类化合物的含量与抗氧化性是否存在着差异，目前尚未见研究报道。试验通过对树莓不同品种、不同发育时期的叶片和果实中黄酮类化合物的含量与抗氧化性进行分析，旨在进一步丰富其生理活性物质的研究内容，拓宽树莓的开发利用渠道[2]。

1 材料与方法

1.1 材料

以果实颜色紫色为的树莓品种美国22（R. idaeus cv. American 22）、红色的欧洲红（R. idaeus cv. European Red）、黄色的金秋（R. idaeus cv. Fall Gold）、黑色的黑树莓（R. idaeus cv. Black Raspberry）为试验材料，其中美国22、欧洲红、金秋3个品种采自东北农业大学香坊试验农场，黑树莓采自黑龙江省农业科学院绥棱浆果所试验基地[3]。美国22和欧洲红越冬埋土，金秋和黑树莓于春季萌芽前进行平茬处理。分别于2013年5～8月底采集4 个品种结果枝和根蘖苗中部位置的叶片，以及各自的青果和成熟的果实，采后冷藏于冰箱内备用。

试剂主要有乙醇、乙酸乙酯、石油醚、NaNO2、AlNO3、FeSO4、水杨酸、H2O2、HCl、Tris-HCl缓冲液、邻苯三酚、过硫酸钾等，都为分析纯，总抗氧化能力检测试剂2，2-联氮-二（3-乙基-苯并噻唑-6-磺酸）二铵盐（ABTS）和1，1-二苯基-2-三硝基苯肼（DPPH）为化学纯，芦丁为参照标准品（大连博迈科技发展有限公司）。

仪器主要有T6新悦型紫外分光光度计（北京普析通用仪器有限公司）、KQ3200 DE型数控超声波清洗器（昆山市超声仪器有限公司）以及电子天平、微型真空泵、旋转蒸发仪等。

1.2 方法

1.2.1 树莓黄酮类化合物的提取与测定 分别称取叶片组织2 g、果实组织5 g，按1∶12和1∶10（g/mL）的比例加入95%乙醇，采用超声波仪在100 W下各提取3 次，每次30 min，真空泵减压过滤。将滤液旋转蒸发后，用乙酸乙酯萃取至下层水相无色透明，其中叶片再用石油醚萃取（去脂、去叶绿素）。取萃取液再次进行旋转蒸发，之后用95%乙醇定容得到黄酮类化合物提取物。以芦丁为参照标准品（大连博迈科技发展有限公司），采用 NaNO2-Al（NO3）3比色法来测定黄酮类化合物的含量，测定波长为510 nm[4]。

1.2.2 树莓黄酮类化合物抗氧化性分析 ①羟自由基·OH清除能力的测定。在试管中加入1.00 mL黄酮类化合物提取液、2.00 mL FeSO4（0.2 mmol/mL）溶液、1.50 mL水杨酸-乙醇（0.2 mmol/mL），最后加0.10 mL H2O2（0.03%），振荡混合，37 ℃水浴下保温30 min，于510 nm波长下测定吸光度A1。加入黄酮类化合物提取液，不加H2O2，测定其对比吸光度A2。以蒸馏水1.00 mL代替黄酮类化合物提取液，测定空白吸光度A0[5]。②超氧自由基O2-·清除能力的测定。采用Marklund法。向2.8 mL、pH 8.2的 Tris-HCl（50 mmol/L）缓冲液中加入黄酮类化合物提取液0.1 mL，25 ℃下保温10 min，然后加入0.1 mL 25 ℃下预温的邻苯三酚（60 mmol/L），摇匀，于420 nm处测吸光度 A1。以0.1 mL HCl（60 mmol/L）溶液代替邻苯三酚（60 mmol/L），此吸光度记为A2，以蒸馏水为空白对照[6]，测定空白吸光度A0。③自由基ABTS·清除能力的测定。精密称取 ABTS 40.00 mg，加入10 mL蒸馏水，加入1.0 mg/mL的过硫酸钾8.00 mL，黑暗下放置16 h，之后将其转移到容量瓶中，加蒸馏水32 mL，用无水乙醇定容至250 mL，放置10 h测定[7]。加0.5 mL黄酮类化合物提取液，然后加入1.5 mL 95%乙醇补至2 mL，再加入2 mL的 ABTS溶液混合，静置30 min，734 nm下测吸光度 A1。以2 mL水代替ABTS溶液，测吸光度A2。以95%乙醇代替黄酮类化合物提取液，测定空白吸光度值A0[8-10]。④自由基DPPH·清除能力的测定。加入黄酮类化合物提取液0.2 mL，加入DPPH·乙醇溶液（25 μg/mL）2.8 mL，于515 nm处测定吸光度A1，直到读数稳定[11]。以2.8 mL 95%乙醇溶液代替DPPH·乙醇溶液，测定吸光度A2。以0.2 mL95%乙醇代替黄酮类化合物提取液，测定空白吸光度A0[12]。

树莓黄酮类化合物提取液对上述4种自由基的清除能力（SA）可表示为：

SA（%）=[1-（A1-A2）/A0）]×100%，

式中，A0为空白吸光度；A1为加入黄酮类化合物溶液反应的吸光度；A2为加入黄酮类化合物溶液未反应的本底吸光度。

所有数据采用SPSS 13.0与Microsoft Office Excel 2003软件进行处理。

2 结果与分析

2.1 树莓叶片、果实中黄酮类化合物在不同生长期含量的比较

4个树莓品种欧洲红、美国22、金秋、黑树莓结果枝叶片黄酮类化合物含量在不同生长期的测定结果见图1。从图1可见，4个树莓品种结果枝叶片黄酮类化合物含量在不同生长时期均表现出一致的变化趋势，即6月>7月>8月>5月（黑树莓平茬后从6月末采摘）；而不同树莓品种叶片在同一生长期内的含量亦有差异，其中6月末是欧洲红的含量最高，其结果枝叶片的黄酮类化合物含量达到3.7 mg/g。

2个夏果型树莓品种（欧洲红、美国22）根蘖苗叶片黄酮类化合物含量在不同生长期的测定结果见图2。从图2可见，欧洲红和美国22的根蘖苗叶片黄酮类化合物含量亦是在6月末最高，但2个品种根蘖苗叶片的黄酮类化合物含量均低于其结果枝叶片的含量。

4个树莓品种的青果和熟果果实中黄酮类化合物含量的测定结果见图3。从图3可见，4个树莓品种的青果果实中黄酮类化合物含量均明显大于熟果。且不论青果还是熟果，其黄酮类化合物含量均是金秋>美国22>欧洲红>黑树莓。

选取4个树莓品种黄酮类化合物含量最高时期（6月末）的结果枝叶片、根蘖苗叶片、青果和熟果果实进行比较，结果见图4。从图4可见，4个树莓品种在6月末的叶片黄酮类化合物含量均大大高于果实的黄酮类化合物含量。

2.2 树莓叶片、果实中黄酮类化合物的抗氧化性比较

4个树莓品种欧洲红、美国22、金秋、黑树莓叶片中黄酮类化合物对·OH、O2-·、ABTS·、DPPH·4种自由基的清除情况分别见图5-a、图5-b、图5-c、图5-d。从图5中可见，4个树莓品种叶片中黄酮类化合物对·OH、O2-·、ABTS·、DPPH·的清除能力均表现为6月末最强；品种中以欧洲红最高，其对4种自由基：·OH、O2-·、ABTS·、DPPH·的清除率分别为74.31%、53.17%、82.88%和91.84%。

4个树莓品种果实中黄酮类化合物对·OH、O2-·、ABTS·、DPPH·4种自由基的清除情况分别见图6-a、图6-b、图6-c、图6-d。从图6中可见，4个树莓品种果实中黄酮类化合物对·OH、O2-·、ABTS·、DPPH·的清除能力均表现为青果远大于熟果；品种中以金秋最高，其对4种自由基的清除能力最强，金秋对上述4种自由基的清除率分别为68.88%、63.88%、92.45%、96.39%。

选取4个树莓品种在6月末采集的叶片（此阶段黄酮类化合物含量最高），与其青果对4种自由基的清除能力进行比较，结果见图7。从图7可见，除了欧洲红对·OH的清除能力表现为叶片大于青果（图7-a）外，其余3个品种对4种自由基（图7-b、图7-c、图7-d）、欧洲红对其他3种自由基的清除能力（图7-a）均表现为青果强于叶片。

3 小结与讨论

试验测定了4个果实颜色不同的树莓品种欧洲红、美国22、金秋、黑树莓的结果枝、根蘖枝叶片和青果、熟果中黄酮类化合物在不同生长期含量的变化，结果表明，4个品种叶片黄酮类化合物含量均在6月末出现最大值，此阶段和5月相比，叶片发育成熟，颜色较深，为具有旺盛光合作用的功能叶片[13]。而在7月末，夏果型树莓欧洲红和美国22已进入果实成熟期，结果枝生长开始衰弱（夏果型树莓的生长特点），叶片中的黄酮类化合物含量也表现为降低；但美国22一直到8月末降低的幅度都不大，可能是由于美国22是一个生长势极强的品种，其结果枝上的叶片绿色期保持时间很长的缘故[14]。欧洲红和美国22结果枝叶片的黄酮类化合物含量均高于根蘖苗，这可能是由于2个品种的结果枝为二年生枝条，含有较多的贮藏营养，因而叶片发育的成熟度更高一些。金秋和黑树莓在萌芽前进行了平茬处理，因此其结果枝皆为一年生枝条，其黄酮类化合物含量低于欧洲红和美国22结果枝的含量，而和欧洲红和美国22根蘖苗的含量相当。试验结果表明，树莓叶片中的黄酮类化合物含量及抗氧化性与品种、植株的生长特性、枝条类型和叶片的发育时期有着很大的关系，因此在实际应用中，若想获得高含量黄酮类化合物的树莓材料，则应选择黄酮类化合物含量高的品种，并在含量高的枝条上于适宜的生长期采摘。

树莓叶片、果实中黄酮类化合物提取物对4种自由基（·OH、O2-·、ABTS·、DPPH·）均表现出一定的清除能力，且其清除能力和黄酮类化合物的含量有关，黄酮类化合物含量越高，清除能力则越强[15]。在4种自由基中，树莓材料对DPPH·清除能力最强，如欧洲红在6月份采集的叶片对DPPH·的清除能力可达到91.84%，说明树莓中的黄酮类化合物具有极强的抗氧化能力。而对叶片、果实中的黄酮类化合物清除自由基能力的分析结果表明，虽然果实中的黄酮类化合物含量低于叶片中的含量[16]，但其抗氧化能力却强于叶片，这可能是由于叶片与果实中的黄酮类化合物种类不同，因此表现出的生理活性也不同造成的。

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