非洲甘蓝种质资源遗传多样性的研究与分析

邓晓辉等

摘要：利用16对SSR引物对17份非洲结球甘蓝（Brassica oleracea L. var. capitata L）种质资源材料和8个中国结球甘蓝品种进行了遗传多样性研究。结果显示，有10对SSR引物在25个资源材料间表现为多态性。共检测到32个等位基因位点，每对引物的等位基因位点变幅为1～4，平均为3.2，等位基因数为25，平均为2.5。UPGMA聚类分析结果显示，在相似系数为0.534的水平上可将25份结球甘蓝资源材料聚为4大类群。揭示了引进非洲结球甘蓝资源的遗传多样性。

关键词：结球甘蓝（Brassica oleracea L. var. capitata L）；SSR；遗传多样性；聚类分析；非洲

中图分类号：S635；Q943.2；Q16.04 文献标识码：A 文章编号：0439-8114（2015）18-4498-03

DOI：10.14088/j.cnki.issn0439-8114.2015.18.027

结球甘蓝（Brassica oleracea L. var. capitata L）起源于地中海一带，是世界上种植最广泛的蔬菜之一，现在中国甘蓝（B. oleracea L.）种植面积有70万hm2，在蔬菜生产上具有重要的地位[1]。在作物育种领域，种质资源越丰富，越易选育出理想的优良新品种，因此，种质资源的遗传多样性对于甘蓝新品种选育意义重大。从系谱关系和表型性状来研究种质资源的遗传多样性虽然有效，但受到环境和人为因素的影响较大，对于引进的国外种质资源，其系谱关系往往难以查找。DNA分子标记技术为从分子层面上揭示种质资源的遗传差异开辟了新的途径。目前国内外研究者应用DNA分子标记技术对甘蓝类资源材料已开展了一些研究，如2011年Saxena等[1]用RAPD和SSR标记分析了甘蓝栽培种的遗传多样性，2013年Izzah等[2]用SSR分子标记研究了分属于6个类型的91个甘蓝品种的遗传多样性，2015年Pang等[3]用SSR和SNP标记分析了叶用甘蓝（B. rapa L）的遗传多样性和群体结构。SSR标记具有共显性、高多态性、高稳定性和经济方便等优点，已经在各项研究中得到了广泛应用。近2年湖北省农业科学院从非洲引进了17份结球甘蓝资源材料，用8份国内推广应用的商品甘蓝为对照，采用SSR技术对其进行分析，以期更好地了解这批资源的遗传多样性和亲缘关系，从而为有效利用这批资源打下基础。

1 材料与方法

1.1 材料

供试材料为湖北省农业科学院近2年从南非、莫桑比克和津巴布韦等非洲国家引进的17份结球甘蓝资源材料和8份国内甘蓝大田生产上推广的商品品种，共25份材料其编号、名称、结球类型、熟性、来源等信息见表1。

1.2 方法

1.2.1 样品总DNA提取 每个参试材料取8个单株的幼嫩叶片，混合后作为提取材料。总DNA提取采用Saghai-Maroof等[4]的CTAB法，并略有改动。提取的DNA样品用0.8%琼脂糖凝胶电泳检测其浓度及纯度，然后稀释成10 ng/μL备用。

1.2.2 PCR扩增 用30对SSR引物对参试甘蓝材料进行分析，SSR引物由北京六合华大基因科技股份有限公司合成，PCR反应参照Saal等[5]的方法，在 Eppendorf Mastercycler PCR仪上进行。采用10 μL PCR体系：DNA（10 ng/μL）1.0 μL，H2O 4.7 μL，10×Buffer 1.0 μL，dNTPs（2.5 mmol/L）0.2 μL，Taq（5 U/μL）0.1μL，25 mmol/L Mg2+1 μL和引物F/R 1 μL×2。反应程序：94 ℃ 预变性5 min；94 ℃变性30 s，53～56 ℃退火30 s，72 ℃延伸60 s，34个循环；72 ℃延伸 10 min。PCR 扩增产物用6%非变性聚丙烯酰胺凝胶进行电泳，缓冲液为5×TBE，电压120 V，电泳45 min左右。银染检测：10%乙醇100.0 mL+0.5 mL冰乙酸固定4 min，0.2% AgNO3染色10 min，蒸馏水洗2～3次，3% NaOH溶液400 mL+7 mL甲醛显影，蒸馏水洗涤2次，照相，保存。

1.3 数据处理

统计分析各样本DNA的扩增条带，在相同的迁移距离上，强带记为1，弱带重复出现也记为1，弱带出现但不重复记为0，无带记为0。样本x与样本y之间的遗传距离参照Nei等[6]的公式计算，GDxy=1-2Nxy/（Nx+Ny），Nxy表示样本x与样本y所共有的条带，Nx代表样本x的所有条带，Ny代表样本y的所有条带。将计算得到的遗传相似系数用软件NTSYS-PC2.1的非加权组平均法（Unweighted pair-group method with arithmetic means，UPGMA）构建聚类图。SSR位点的多态性按公式PIC=1-∑Pi2计算，有效等位基因数为E=1/∑Pi2，Pi为第i位点的基因频率。

2 结果与分析

2.1 SSR标记的多态性

在供试的非洲结球甘蓝资源材料中随机选择5个不同来源的材料进行SSR引物筛选，选取其中扩增条带清晰、多态性高的引物用于供试材料的遗传多样性分析。从30对引物中选出16对多态性高的SSR引物用于进一步的试验，这16对SSR引物在25个材料间能扩增出产物的有10对，占所用引物的62.5%。在10对引物上共检测到32个等位基因位点，每对SSR引物的等位基因位点数变幅为1～4个，平均为3.2个。其中，24号引物的等位基因位点数最多，为4个；大部分引物的等位基因位点数在2～3个范围内。

2.2 甘蓝材料遗传相似性分析

根据10对SSR引物在25份供试材料中所获得的32个等位基因位点，按Nei的方法利用NTSYSPC2.1统计分析软件计算供试品种间的遗传相似系数（GS），结果遗传相似系数变化范围在0.24～0.87 之间。其中12号和26号的遗传相似性最大（GS=0.87），说明两者有非常近的遗传关系；而65号与34号、37号之间的遗传相似性最小（GS=0.24），说明它们之间的遗传距离比较远。

2.3 聚类分析

以获得的SSR标记遗传相似系数矩阵为原始数据，在NTSYS-2.0软件上用UPGMA法对参试所有结球甘蓝资源材料进行聚类分析，并绘制树状图，具体见图1。从图1可见，以遗传相似系数0.534为阈值，可将参试的25份材料分为4个大类群。第Ⅰ类群为1个材料，标号为65号，是来源于毛里求斯的中熟扁圆结球甘蓝；第Ⅱ类为34号和37号，都是来自中国的中熟扁圆结球甘蓝商品品种；第Ⅲ类为95号，为来自坦桑尼亚的中熟扁圆结球甘蓝；第Ⅳ类为余下的其他结球甘蓝材料；其中在相似系数0.662处，7号、32号、12号、26号、96号可聚为一类，球形都为牛尖形，都来自非洲，12号和26号球形一致又都是早熟类型，因此在聚类分析上表现为十分相似。从图1还可看出，在相似系数0.706处，圆头中熟的1号、6号、17号和47号聚在一起，这4个材料都来自非洲；说明相同来源的材料亲缘关系较近，相同生态类型的材料亲缘关系也较近。上述聚类结果说明，利用32个SSR标记可以确定本试验中25份不同类型结球甘蓝材料间的遗传差异。

3 讨论

试验结果显示，SSR标记可用于对引进的非洲结球甘蓝种质资源进行有效的遗传多态性检测。以遗传相似系数为原始数据进行UPGMA分析，在相似系数为0.534的水平时可将25个甘蓝种质材料聚为4个大类，聚类分析结果与非洲结球甘蓝资源的地理来源、熟性和球形有一定的相关性，这与宋立晓等[7]、缪体云等[8]、苗明军[9]和李宁等[10]的研究结果一致。并且同一地域的多数材料可以聚在一起，如第Ⅱ类群的2个材料均来源于中国，但同时也存在不同地理来源的材料聚在一起的现象，也许是因为不同地区间资源的交流致使某些基因在不同地区种质间的相互渗透所致。同一球形和熟性的材料大多聚在一起，如牛尖形的材料形成一个聚类，但其中来自东非和南非的2个羽衣甘蓝也聚在了该类，而且独立成为了一个小类，可能是采用的标记较少，没能将其从牛尖形中分离出去造成的。

试验对非洲引进的17份甘蓝资源和国内的8份甘蓝商品品种进行了遗传多样性和亲缘关系研究，发现引进的非洲资源与国内的甘蓝品种遗传上存在差异，说明引进的非洲甘蓝种质资源具有不同的基因背景，能丰富中国的甘蓝种质资源，增加其遗传多样性，这将使今后育成品种的适应性更广、性状更加优异。

参考文献：

[1] SAXENA B， KAUR R， BHARDWAJ S V. Assessment of genetic diversity in cabbage cultivars using RAPD and SSR markers[J]. Journal of Crop Science and Biotechnology， 2011， 14（3）： 191-196.

[2] IZZAH N K， LEE J， PERUMAL S， et al. Microsatellite-based analysis of genetic diversity in 91 commercial Brassica oleracea L. cultivars belonging to six varietal groups[J]. Genetic Resources and Crop Evolution， 2013， 60（7）： 1967-1986.

[3] PANG W X， LI X N， CHOI S R， et al. Development of a leafy Brassica rapa fixed line collection for genetic diversity and po pulation structure analysis[J]. Molecular Breeding， 2015， 35：54.

[4] SAGHAI-MAROOF M A， SOLIMAN K M， JORGENSEN R A， et al. Ribosomal DNA spacer-length polymorphisms in barley： Mendelian inheritance，chromosomal location and population dynamics[J]. Proceedings of the National Academy of Sciences of the USA，1984，81（ 24） ： 8014-8018.

[5] SAAL B， PLIESKE J， HU J， et al. Microsatellite markers for genome analysis in Brassica，Ⅱ.Assignment of rapeseed microsatellite to the A and C genomes and genetic mapping in Brassica oleracea[J]. Theor Appl Genet，2001，102（5）：695-699.

[6] NEI M， LI W H， Mathematical model for studying genetic variation in terms of restriction endouncleases[J]. Proc Natl Acad Sci USA， 1979， 74： 5269-5273.

[7] 宋立晓，严继勇，曾爱松，等.结球甘蓝遗传多样性的SSR分析[J].江苏农业学报，2013，29（1）：151-156.

[8] 缪体云，薄天岳，陈锦秀，等.甘蓝种质资源遗传多样性的SRAP分析[J].分子植物育种，2010，8（1）：94-98.

[9] 苗明军.SSR标记在甘蓝遗传多样性及杂种鉴定中的应用研究[D].重庆：西南大学，2010.

[10] 李 宁，姚明华，焦春海，等.亚洲及非洲茄子种质资源主要农艺性状的遗传多样性分析[J].湖北农业科学，2014，53（23）：5769-5774.