木质纤维素降解菌群的筛选组配及其对秸秆的降解效果

卢月霞等

摘要：采用苯胺蓝脱色法和纤维素刚果红培养基鉴别法，从所采样品中分离筛选到8株能较好降解木质纤维素的菌株。对8个菌株的LiP酶、MnP酶、Lac酶、C1酶、Cx酶和纤维二糖酶（BG酶）分别进行测定，得到4株酶类齐全且酶活较高的菌株H14、H17、W15、W23。在分析菌株相容性基础上进行菌株组合，对菌群的发酵条件进行优化，，在优化条件下的LiP酶活性可达28.02 U/mL，Cx酶活性达38.16 U/mL，对玉米秸秆粉末的降解率高达35.24%。该菌群具有进一步研究价值。

关键词：木质纤维素降解；混合菌群；秸秆；降解效果

中图分类号：X172 文献标识码：A 文章编号：0439-8114（2015）18-4464-04

DOI：10.14088/j.cnki.issn0439-8114.2015.18.019

中国拥有数量庞大的秸秆资源，由于秸秆结构不均一，且各部分的化学成分非常复杂，使得秸秆在短时间内不容易被降解。很多秸秆在田间被直接烧掉，破坏了生态平衡，使土壤肥力衰竭，造成农业上的恶性循环，而且污染环境。利用适合常温、组分失衡的微生物，构建具有高效木质纤维素降解功能的混合菌群，使秸秆资源能被快速充分的利用，对于促进秸秆资源的有效利用、解决环境污染、保持经济可持续发展具有重大现实意义。为获得高效降解木质纤维素的混合菌群，以解决秸秆类固废污染和秸秆资源的有效利用，本试验进行了木质纤维素降解菌群的筛选组配及其降解效果研究。

1 材料与方法

1.1 材料

试验分离所需样品来自富含枯枝落叶的土壤和养殖场畜禽粪便。

初筛培养基、刚果红鉴别培养基和液体发酵培养基的制备方法均参照文献[1]。

木质素酶检测培养基（BM-Azure B 培养基）的成分为：酵母粉0.1 g/L， 葡萄糖2 g/L， Azure B 0.1 g/L， 琼脂18 g/L， pH 6.5～7.0。

1.2 方法

木质纤维素降解菌的初筛方法参照文献[2]。

1.2.1 木质纤维素酶活定性检测 初筛得到的菌株分别用灭菌牙签点接到鉴别培养基和苯胺蓝脱色培养基上，28 ℃培养48 h，选择菌落周围产透明圈和脱色圈的菌株进行液体发酵测定酶活。

1.2.2 木质纤维素酶活定量测定 将筛选菌株接种于液体发酵培养基，28 ℃，160 r/min摇床振荡培养1～2 d， 3 500 r/min离心10 min，收集上清液对菌株的各类酶活进行定量测定。纤维素酶包括三类酶，分别为Cx、C1和BG，其测定过程参照文献[3，4]进行；木质素降解酶主要包括三类：Lip、MnP和Lacase，3种酶活测定方法参考文献[5]。

1.2.3 菌株相容性分析及菌群构建 将各酶活较高的菌株两两混合，点种于初筛培养基平板上，定期观察菌株的生长情况，分析菌株之间的相容性，合理构建混合菌群。将相容性强的菌株经过夜培养后的菌悬液以体积比1∶1混合，将混合菌液接种到天然纤维素培养基中连续培养一周，定期测定各酶活，并测定秸秆类物质的降解率。

1.2.4 菌群产酶条件优化研究 将优化组合接种于液体发酵培养基上，研究温度、碳源、氮源、接种量对产酶的影响，优化菌群发酵条件。

1.2.5 菌群对秸秆类木素纤维素物质的降解率测定 根据降解前后底物干重的变化计算降解率。

2 结果与分析

2.1 木质纤维素降解菌的分离纯化与筛选

参照文献[2]中所述方法分离纯化出78个菌株，按照1.2.2的方法检测出具有酶活性的菌株32株，其中8株菌的透明圈和脱色圈比较明显，它们在刚果红培养基平板和苯胺兰脱色平板上透明圈和脱色圈直径见表1，透明圈和脱色圈筛选法虽然直接快速，但仅以透明圈和脱色圈直径大小作为菌株木质纤维素酶活力大小的惟一指标并不可靠，为此需对各菌株酶系特点进行分析。

2.2 各菌株酶系特点

木质素和纤维素的降解需要多种酶共同作用，木质素降解酶系主要包括木质素过氧化物酶（LiP）、锰过氧化物酶（MnP）和漆酶（Laccase），这些酶可在木质素聚合物内形成自由基，导致键的不稳定从而打断木质素大分子，LiP被认为是在木质素类物质降解过程中起关键作用的酶。纤维素降解必须依靠外切型葡聚糖酶（C1）、内切型葡聚糖酶（Cx）、纤维二糖酶（BG）3种酶协同作用才能完成，因此需要全面系统分析菌株各种木质素和纤维素酶的活性。分别对8个菌株的6类酶进行定量测定，最后得到4株酶类齐全且酶活性较高的菌株，H14、H17、W15、W23，H14和H17为细菌，W15和W23为真菌。4菌株各类酶活测定结果如图1。由图1可知，菌株W23的LiP和Cx酶活最高，分别达到10.24 U/ mL和19.33 U/mL，但该菌株其他酶活较低，菌株各类酶活高低不同是限制天然木质纤维素彻底降解的重要因素。

2.3 菌株相容性分析

将4菌株两两混合点接于初筛培养基平板上，定期观察菌株的生长情况，具体生长情况见表2，结果表明，各菌株可以共存，彼此之间无拮抗现象发生，菌落之间无覆盖或限制现象，各菌株之间的相容性为菌株组合协同降解天然木质纤维素提供了研究基础。

2.4 菌群构建及对天然木质纤维素降解能力测定

将4菌株过夜培养后的菌悬液，以体积比1∶1∶1∶1混合，将混合菌液分别接种到玉米秸秆发酵液连续培养一周，定期测定发酵液各类酶活性，由图2可知，各种酶活性均呈现先增高后降低的趋势，各类酶活性高峰时间集中在第2天和第3天，且Cx在三类纤维素酶中活性最高，LiP在木质素三类酶中也表现最明显，Cx最高酶活性可达25.69 U/mL，LiP最高酶活性达16.41 U/mL，远远高于单菌株各类酶活性。天然木质纤维素的降解需要各类酶协同作用，在实际应用中，应充分重视多种微生物之间的协同效应。在本试验中，木质纤维素降解的关键酶是Cx和LiP，为此选择这两种酶作为产酶条件优化的测定指标。

2.5 菌群产酶条件优化

2.5.1 温度对酶活性的影响 将混合菌液以2%的接种量接种于液体发酵培养基中，置于不同温度下，180 r/min摇床振荡培养72 h，取样测定LiP和Cx的活性，由酶活性测定结果（图3）可知，菌群在30 ℃时的酶活性最高，该温度比较适合菌群的生长，故此温度下菌群的产酶能力较强。曲线总体趋势显示初期酶活性随温度增高而增加，温度超过30 ℃时，酶活性呈下降趋势。

2.5.2 碳源对酶活性的影响 除去碳源的液体发酵培养基作为基础培养基，分别加入不同碳源：木屑、玉米糠、稻米糠、麦麸和甘蔗渣，于30 ℃，180 r/min摇床振荡培养72 h，测定各发酵液LiP和Cx的活性，如图4所示，碳源对菌株产酶能力有很大的影响，玉米糠可以明显促进LiP和Cx的产生，而甘蔗渣作为碳源酶活性相对较低，

2.5.3 氮源对产酶影响 以除去氮源后的液体发酵培养基作为基础培养基，分别加入不同氮源即酵母膏、蛋白胨、牛肉膏、（NH4）2HPO4、 NH4H2PO4和尿素，培养条件同上，酶活测定结果（图5）表明酵母膏更有利于酶的产生，（NH4）2HPO4、 NH4H2PO4能够缓冲发酵过程中pH的变化，促进产酶的效果较好。

2.5.4 接种量对产酶的影响 将菌群以不同接种量接种于液体发酵培养基，于30 ℃，180 r/min摇床振荡培养72 h后测定各发酵液LiP和Cx的活性，接种量不同，酶活性相差较大，以4%的接种量接种酶活最高（图6），接种量太低菌株适应环境较慢，所以产酶能力相对较差。同时木质纤维素结构和成分的复杂性也决定在接种量较大情况下更有利于酶的产生。

2.6 菌群对不同底物的降解率测定结果

液体培养基中分别以木屑、玉米秆粉、稻米糠、麦麸和甘蔗渣作为碳源，将菌群接种液体培养基，30 ℃，180 r/min摇床振荡培养7 d后，测定菌群对木质纤维素类底物的降解率，降解结果如图7所示，在5种木质纤维素物质中，菌群对玉米秆粉的降解率最高，可达35.24%，其次是甘蔗渣、稻米糠和麦麸，降解率分别为28.12%、25.36%和20.14%，对木屑的降解率最低，只有19.15%，菌株降解率取决于底物结构，所以玉米秆粉更适合作为发酵底物。

3 小结与讨论

本研究构建的混合菌群具有较高的LiP酶和Cx酶活性，且对木质纤维素类物质具有较高的降解率，显示出其在未来木质纤维素物质降解转化方面的应用潜力。木质纤维素的降解是真菌、细菌及相应微生物群落共同作用的结果，利用微生物菌群降解木质纤维素对实现木质纤维素快速转化和开发木质纤维素废弃物处理的新菌剂必然具有一定的理论指导和现实意义。木质纤维素生物降解不仅依赖于微生物自身的降解能力，在很大程度上还取决于环境条件，培养温度、碳源、氮源、接种量等都对菌株产酶能力有着较大的影响，因此，优化菌群的产酶条件对提高降解效率、加快降解进程尤为重要，这方面的工作有待于进一步完善。

参考文献：

[1] 卢月霞，吕志伟，袁红莉，等.纤维素降解菌的筛选及其混合发酵研究[J].安徽农业科学，2008，36（10）：3952-3853.

[2] 卢月霞，宋惠月，刘凯楠，等.一株纤维素降解菌的筛选及其产酶条件优化[J].湖北农业科学，2010，49（1）：95-97.

[3] 殷中伟.秸秆纤维素高效降解菌株的筛选及对秸秆降解效果初步研究[D].北京：中国农业科学院，2010.

[4] 刘 洁，李宪臻，高培基.纤维素酶活力测定方法评述[J].工业微生物，1994，24（4）：27-32.

[5] WANG Y X，VAZQUEZ-DUHALT R，PICKARD M A.Effect of growth conditions on the production manganese peroxidase by three trains of Bjuerkandera adusta[J]. Can J Microbiol，2001， 47：277-282.