福建宁德黑眶蟾蜍染色体核型及其银染研究

高 文，肖琴云



福建宁德黑眶蟾蜍染色体核型及其银染研究

*高 文，肖琴云

（宁德师范学院生物系，福建，宁德 352100）

以骨髓细胞作为材料制备染色体标本，对福建宁德黑眶蟾蜍()的染色体核型及银染进行观察与分析。结果表明：染色体数为2n = 22(20M+2SM)，NF = 44，配成11对染色体，由6对大型染色体和5 对小型染色体组成，未发现与性别分化相关联的异型染色体，染色体未见银染区域。与已报道的广东广州、福建福州、广西南宁、浙江温州、云南腾冲、台湾等不同地域的黑眶蟾蜍核型等研究资料进行比较，发现不同产地的黑眶蟾蜍核型在SM数目和顺序、次缢痕或随体的位置、银染区域等方面都存在着一定的差异。

福建宁德；黑眶蟾蜍；染色体核型；银染

黑眶蟾蜍()属两栖纲 (Amphibia)，无尾目(Anura)，蟾蜍科(Bufonidae)，蟾蜍属()，在中国主要分布在南部地区[1]。目前在国内已报道过不同地域黑眶蟾蜍的相关资料，如来自广东广州、福建福州、广西南宁、浙江温州、台湾、云南腾冲等地方，主要对黑眶蟾蜍的核型等进行了研究[2-7]，但未见对宁德地区黑眶蟾蜍染色体核型的报道。本研究通过对宁德黑眶蟾蜍的染色体核型和银染研究，并与广州、福州、南宁、温州、台湾、腾冲六个地区黑眶蟾蜍的染色体研究结果进行比较，来探讨黑眶蟾蜍不同地理居群的核型和银染的异同点。研究结果不仅为该物种的起源、演化与分类等提供科学依据，同时也为其遗传学和细胞生物学研究提供基础资料。

1 材料与方法

1.1 材料和器材

黑眶蟾蜍10只（雌4雄6），2014年4月初采自福建宁德市城郊。

实验器材：L550台式低速离心机、电子天平、DHG-9123A型电热恒温鼓风干燥箱、BA210Digital数码显微镜等。

1.2 方法

1.2.1 制备染色体标本

骨髓细胞染色体标本的制作根据：秋水仙素—低渗—空气干燥法[8]来制备染色体标本，并加以适当的修改。

1.2.2 观察染色体组型

取染色体标本玻片，Giemsa染色[9], 镜检，计数80个中期分裂相，选取10个染色体分散好、主缢痕清晰的分裂相进行拍照和记录。观察染色体组型，计算染色体的相对长度(%) (1条同源染色体长度/单套基因组染色体总长度×100)和臂比指数（长短臂之比= 长臂的长度(q)/短臂的长度(p)），按Green等提出的分组标准进行染色体分类，相对长度(%) > 9%的为大型染色体组，相对长度(%) < 7%的为小型染色体组。按照分组标准进行着丝点定位：臂比值在1.0~1.7之间为中部着丝点(M)染色体；在1.7~3.0之间为亚中部着丝点(SM)染色体；在3.0～7.0之间为亚端部着丝点(ST)染色体；大于7.0为端部着丝点(T)染色体。

1.2.3黑眶蟾蜍的银染（Ag-NORs）

参照Howel和Black的明胶显示液快速银染法进行银染[11]，稍加改进。取10 d内的染色体标本玻片，滴加5滴明胶显影液，再滴加10滴50% AgNO3，混匀后放入预热至70 ℃恒温箱中，显影10 min后取出，用事先预热过的蒸馏水（约70 ℃）冲洗干净, 后用5%Giemsa复染1 min，自然空气干燥后进行镜检，在油镜下观察染色体分散良好的中期分裂相、确定银染点，并进行拍照和记录。

2 结果与分析

2.1 黑眶蟾蜍的染色体组型

观察的80个中期分裂相中，2n = 22占86%，选择10个分散较好的中期分裂相拍照，按照染色体相对长度的大小顺序进行排列并编号（图1），各号染色体的相对长度(%)和臂比指数见表1。结果表明：黑眶蟾蜍的染色体数目为2n = 22，配成11对同源染色体. 有10对中部着丝点(M)染色体和1对亚中部着丝点(SM)染色体，在第11对染色体上有一对明显的次缢痕，并在其末端具一对随体样特殊标志性特征。在雌、雄个体之间并未发现与性别分化相关联的异型染色体。

图1 黑眶蟾蜍染色体的中期分裂相和染色体组型

表1 黑眶蟾蜍的染色体测量统计数据（± SE）

Table 1 The chromosome statistical data of Bufo melanostictus

表1 黑眶蟾蜍的染色体测量统计数据（± SE）

组别序号相对长度1）臂比值2）着丝点位置3） 116.94 ± 0.911.26 ± 0.06M 215.21 ± 1.321.37 ± 0.19M 312.95 ± 0.531.39 ± 0.22M 411.89 ± 0.421.74 ± 0.12SM 510.82 ± 0.181.26 ± 0.03M 68.61 ± 0.371.45 ± 0.09M 75.94 ± 0.491.30 ± 0.21M 85.44 ± 0.401.39 ± 0.11M 95.11 ± 0.411.29 ± 0.18M 104.60 ± 0.541.29 ± 0.19M 113.87 ± 0.181.57 ± 0.12M

根据染色体的大小、形态、相对长度以及臂比指数等特征，所有染色体可分为2组：

A组为大型染色体（No.1~6），共6对，相对长度(%)为16.94 ± 0.91~ 8.61 ± 0.37。仅第4对为SM型，其余5对均为M型。其中第1对染色体最大，其相对长度(%)大于16.0，很容易识别出来。第3对、第4对和第5对染色体在相对长度上并没有太大差别（相对长度仅差1左右），但是三者的着丝点位置不一样，其中第4对染色体的臂比指数为1.74，属于SM型，且相对长度在第3～第5对染色体中处于居中长度，因此第4对染色体很容易识别出来。第6对染色体也属于M型，是大型染色体组里相对长度最小的一对，也容易与其它染色体区分开来。

B组为小型染色体(No.7~11)，共5对，相对长度(%)为5.94 ± 0.49~3.87 ± 0.18，都是M型。第7对为小型染色体组里最大的一对，其相对长度(%)为5.94 ± 0.49，很容易鉴别出来。第8~第11对染色体的相对长度差别较小，其中第11对是小型染色体组里相对长度最小的，但其臂比指数却是小型染色体中最大的，因此很容易被识别。

2.2 黑眶蟾蜍的Ag-NORs

通过Ag-NORs结果可以看出（图2），在黑眶蟾蜍的11对染色体中均未出现Ag-NORs。表明其不存在活性或者具有活性较弱的rRNA基因，因此细胞没有明显的Ag-NORs出现[12]。

图2 黑眶蟾蜍的Ag-NORs

3 讨论

福建宁德黑眶蟾蜍的染色体：2n = 22(20M +2SM)，NF = 44，为6+5模式。其中No.4为 SM型，其余均为M型，一对次缢痕在11 pter上，并在其末端有一对随体，通过与其它地区黑眶蟾蜍染色体核型的比较显示(表2)，广东广州、福建福州、广西南宁、浙江温州、台湾、云南腾冲、福建宁德七个不同地区黑眶蟾蜍染色体的No.1、2、3、5、6、9、11均为M型。其中高建明[3]报道福建福州的黑眶蟾蜍和马军[4]报道的广西南宁黑眶蟾蜍染色体No.4、No.9均为SM型；何海晏[2]报道广东广州的黑眶蟾蜍和刘万兆等[7]报道云南腾冲的黑眶蟾蜍染色体在No.4、No.7为SM型；钱晓薇[5]报道浙江温州的黑眶蟾蜍和笔者所报道的福建宁德黑眶蟾蜍No.4为SM型；只有Kuramoto 等[6]报道的台湾黑眶蟾蜍No.10染色体为SM型。在染色体上的主次缢痕方面，广东广州、福建福州、广西南宁、浙江温州、云南腾冲、福建宁德六个地区的一对次缢痕均在11 pter上，且在其末端有一对圆形或长形的随体，只有台湾地区的次缢痕存在于10 pter上。

表2 中国部分地区黑眶蟾蜍的核型比较

n：二倍体数目； SM：亚中部着丝点； M：中部着丝点 SC:次缢痕 p：短臂； ter：端区；

对七个地区黑眶蟾蜍染色体的Ag-NORs结果比较发现，除了广西南宁和云南腾冲报道的黑眶蟾蜍在第11对染色体的短臂近着丝点区发现了明显的Ag-NORs外，其它地区黑眶蟾蜍染色体均未发现Ag-NORs区域。Ag-NORs所定位的位置和呈现的数目会随着物种的不同或改变而存在或大或小的差异，这可能是七个地区银染结果出现差异的原因。这个特性在研究物种的起源、演化与分类起着极其重要的指引作用。

另外我们通过比较发现，福建宁德黑眶蟾蜍染色体核型所得的结果与浙江温州有很大的相似性，与台湾地区报道的存在着明显差异，这可能是由于地域原因引起在染色体核型上的差异。上述七个不同地区研究结果表明黑眶蟾蜍的2n均为22，NF=44，均由双臂染色体组成，可配成11对同源染色体，并可分为大型染色体和小型染色体两大组，即由6对大型染色体和5对小型染色体组成，核型模式为典型的对称型（S型）核型[6]。说明各个地域之间的黑眶蟾蜍有很近的亲缘关系，其染色体在遗传演变上具有相对保守性和同一性[13]。但是不同地理区域分布的黑眶蟾蜍又存在着明显而值得注意的差异。这些差异不仅表现在核型组成上，同时还包括在次缢痕和Ag-NORs上的差异。本研究通过对不同地理区域黑眶蟾蜍核型和银染研究比较，证实其染色体确实既具有保守性又存在差异。

从核型组成可以看出，七个地区可分成两类：20M+2SM、18M+4SM，暗示不同地区的亲缘关系。但福建的两个地区（宁德和福州）却不完全相同，原因值得探究。另台湾地区研究结果的特殊性：其SM和SC与其他地区都不一样，这与其存在地理隔离是否具有相关性也值得我们进一步探讨。探讨不同区域黑眶蟾蜍染色体核型的变化规律，可为该物种的起源、分类及其演化（进化和系统发育）等方面提供有价值的资料[14]。

参考文献：

[1] 谢宇. 生命力顽强的两栖爬行动物[M]. 天津: 天津人民出版社, 2012:30-32.

[2] 何海曼. 广东九种无尾类染色体组型比较研究[J]. 两栖爬行动物学报, 1986, 5(3): 171-175.

[3] 高建民. 黑眶蟾蜍和中华蜍中华亚种染色体组型的比较的研究[J]. 武夷科学, 1983, 3: 69-79.

[4] 马军. 广西黑眶蟾蜍核型及Ag-NOR研究[J]. 广西医科大学学报, 1998, 15(4): 14-16.

[5] 钱晓薇. 黑眶蟾蜍、黑斑蛙、中国雨蛙不同地理居群的染色体多样性[J]. 四川动物,2001,20(4) :181-184.

[6] 李树深. 中国两栖动物细胞分类学[M]. 北京:科学出版社, 2007:131-133.

[7] 刘万兆,杨大同. 云南西部高黎贡山两种蟾蜍的核型, C带, 银染的研究(无尾Anura: 蟾蜍科 Buffonlnae) [J]. 两栖爬行动物学研究,2004(第 6、7辑):1-4.

[8] 孙爱群,田应洲,谷晓明.红点齿蟾的染色体组型初报[J]. 六盘水师范高等专科学校学报, 1999 (2): 51-54.

[9] 李国珍. 染色体及其研究方法[M]. 北京: 科学出版社, 1985:127-131.

[10] Green D M. Bogart J P, Anthony E H, et al. An interactive, microcomputer-based karyotype analysis system forcytotaxonomy [J]. Coput Biol Med, 1980, 10: 219-227.

[11] Howell W M, Black D A. Controlled Silver-staining of nucleolus organizer regions with a portative colloidal developer al-step method [J]. Experientia, 1980, 36: 1014-1015.

[12] 郭超文,董永文.天台蛙和合征姬蛙的核型及其银染色研究[J]. 遗传, 1991, 13(2): 6-8.

[13] 李树深,胡健生.中国棘蛙属染色体演化和核型的地理分化[A].中国动物学会.中国动物科学研究—中国动物学会第十四届会员代表大会及中国动物学会65周年年会论文集[C]. 1999:976-982.

[14] 李树深,王应祥,李崇云,等.四种无尾两栖类染色体组型的比较研究[J]. 动物学研究, 1981, 2(1):17-24.

RESEARCH ON THE KARYOTYPE AND Ag-NORs OF FUJIAN NINGDE

*GAO Wen, XIAO Qin-yun

（Department of Bioengineering, Ningde Normal University, Ningde, Fujian 352100, China）

The observations and analysis ofkaryotype, Ag-NORs were based on the chromosome sample from the bone marrow cells. The results showed that: the number of chromosome was 2n = 22 (20M+2SM), NF = 44, with 11 pairs of chromosomes consisting of 6 pairs of megachromosome and 5 pairs of minisome. No heteromorphic chromosome was found correlating with sex differentiation. No region of the Ag-NORs chromosome was found. Compared with the reported research aboutkaryotype from Guangzhou Guangdong, Fuzhou Fujian, Nanning Guangxi, Wenzhou Zhejiang, Tengchong Yunnan, Taiwan and other different regions, it showed that there were some differences aboutkaryotype from different regions in the SM number and the order, secondary constriction and satellite, Ag-NORs areas and so on.

Fujian Ningde;; karyotype; Ag-NORs.

1674-8085(2015)01-0046-04

Q343.2+2

A

10.3969/j.issn.1674-8085.2015.01.009

2014-07-07；修改日期：2014-11-27

*高 文(1966-)，女，福建福鼎人，副教授，主要从事动物生理研究(E-mail:gaowen2004@126.com) ;

肖琴云(1991-)，女，福建福安人，宁德师范学院生物系2010级生物技术专业本科生(E-mail:262354008@qq.com).