灵芝多糖相对分子量检测及其单糖组分分析

叶素丹（浙江经贸职业技术学院，浙江　杭州 310018）

灵芝多糖相对分子量检测及其单糖组分分析

叶素丹
（浙江经贸职业技术学院，浙江杭州 310018）

灵芝多糖具有多种药理活性，由于其来源广泛导致其理化特性、分子量、化学结构差异不均。本文利用蒸发光散射检测器的高效液相凝胶渗透色谱（HPGPC-ELSD）对常规制备过程获得的一个主要灵芝多糖纯化组分GLP进行重均分子量分析；同时利用气相分析了该GLP的单糖组分。结果发现：该灵芝多糖纯化组分GLP的分子量为91.6 kD，单糖组分分别为葡萄糖、半乳糖、木糖、鼠李糖、阿拉伯糖和甘露糖，其中以葡萄糖和半乳糖为主。本研究为开展科学、合理的灵芝多糖理化特性的分析方法进而开发灵芝多糖具有重要意义。

壁灵芝多糖；相对分子量；单糖组分；检测

灵芝为灵芝科灵芝属真菌，具有极高的营养、保健、医疗价值，作为一种名贵中药在我国用于临床已有悠久的历史。现代医学研究证明灵芝具有抗肿瘤、提高免疫力、延缓衰老、抗炎症、降血糖、降血脂等药效［1-2］。灵芝的多种药理活性大多和灵芝多糖有关，灵芝多糖来源于灵芝子实体或菌丝体中。提取灵芝多糖的原料较多，不同来源的灵芝多糖含量、理化特性、分子量、化学结构等方面有所差异，且多糖化学结构复杂，多糖结构又与其生物功能密切相关［3-4］。目前市场上灵芝加工产品较多，其质量参差不齐，因此，建立一种科学、合理的灵芝多糖理化特性的分析方法以及对其功效活性进行准确评价对开发灵芝多糖具有重要指导意义。

1　材料与方法

1.1材料、试剂及主要仪器

灵芝，产自江西省。Dextran Standard T系列标准品，Pharmacia公司；bradford法蛋白测定试剂盒，碧云天公司；Agilent 1100系列高效液相色谱仪（HPLC），蒸发光散射检测器（ALLTECH ELSD 2000ES）ALLTECH公司；TSK-GEL G3000PWXL，TOSOH公司；气相色谱：GC：6890N（Adgilent，USA）；色谱柱：J&W DB一5MS（30 m×0.25 mm i.d.，0.25 μm df）。其它试剂为国产分析纯。梅特勒AL-204分析天平。

1.2灵芝多糖的制备

将灵芝子实体粉碎，取200 g，沸水煎煮，过滤，Saveg法去蛋白质，活性炭脱色，乙醇沉淀，冷冻干燥，得2.52 g黄色粉末，为灵芝粗多糖CGLP（Crude Ganoderma Lucidum polysaccharides）。将灵芝粗多糖CGLP溶于水，经Sephacryl S-300凝胶柱层析，获得一个主要灵芝多糖纯化组分GLP，经水透析、冻干后得浅黄色絮状粉末为GLP。采用蒽酮-硫酸法测定灵芝多糖GLP糖含量。考马氏亮蓝G-250法测定蛋白质GLP的蛋白质含量，

1.3灵芝多糖纯化组分的分子量及分布

灵芝多糖的分子量及分布采用高效液相凝胶渗透色谱法 （HPGPC）分析。以Dextran Stan-dard T系列葡聚糖标准品T-10，T-40，T-70，T-500和 T-2000（分子量分别为:10000，40000，70000，500000和2000000）配制成质量百分比浓度为0.1%的水溶液。配制相同浓度的灵芝多糖水溶液。

HPGPC分析条件： 色谱柱 TSK-GEL G3000PWXL 7.8 mm×300 mm；流动相：H2O；流速：0.55 mL/min；进样量15 μL；蒸发光散射检测器（ELSD），载气为氮气，流速2.5 L/min。以标准品重均相对分子质量对数lgMr与保留时间tR线性回归方程为标准曲线，计算GLP分子量。

1.4单糖组成分析

取纯化的灵芝多糖样品5 mg，加入2 mol/L三氟乙酸3.0 mL，封管。105℃水解9 h，冷却后减压抽去TFA。加少量甲醇，减压抽干，反复几次以除去TFA。最后将水解产物溶于蒸馏水。水解产物进行糖醇乙酸酯衍生化［5］。水解产物及标准单糖用硼氢化钠还原，滴入醋酸分解过量硼氢化钠，减压蒸干后加入甲醇反复处理蒸干。加入醋酐：无水吡啶 （1∶1）于100℃水浴乙酰化20 min，重溶于氯仿进行气相分析。气相分析条件：HP25 5%苯甲基硅烷毛细管柱（30.0 m×0.25 mm ×0.25 μm）。程序升温110℃至280℃，5℃/min，保留2 min，FID检测器，载气为氮气，流速25.0 mL/min，检测器温度300℃。

2　结果与分析

2.1GLP化学组成

蒽酮硫酸法测得纯化制备的GLP总多糖质量百分含量为88.65%，蛋白质含量为6.23%。灵芝多糖为一种结合蛋白肽的多糖复合物。GC分析表明灵芝多糖GLP的多糖部分由6种单糖组成（见表1），分别为葡萄糖、半乳糖、木糖、鼠李糖、阿拉伯糖和甘露糖，各单糖组成的摩尔比表明GLP以葡萄糖和半乳糖为主，占到总糖组成的近90%。

表1　灵芝多糖GLP的单糖组成及摩尔比

2.2GLP的分子量分析

灵芝多糖GLP的HPGPC-ELSD图谱见图1，标准曲线为：Y=-0.38X+9.72 r2=0.9920，根据此标准曲线计算，灵芝多糖GLP主要组分的重均相对分子量为91626。

图1　灵芝多糖GLP的HPGPC-ELSD图谱Fiure 1 HPGPC-ELSD Chromatogram of GLP

3　结论

对单糖及寡糖类的分析，传统的方法是纸层析和薄层层析法，后来发展了更为准确的HPLC法，而糖类在紫外区无吸收，只能采用衍生化法或示差折光检测器，这些方法存在灵敏度及基线漂移等诸多因素的影响［6］。蒸发光散射检测器（ELSD）能够测定没有紫外吸收或为紫外末端弱吸收的样品，天然产物中的许多成分无疑找到了直接、准确的测定方法。目前，国内外已有应用HPLC-ELSD法检测这类大分子物质的报道，如黄芪多糖、云芝糖肽、天花粉蛋白等有少许关于应用HPLC-ELSD的分析研究［7-8］。本研究采用基于蒸发光散射检测器的高效液相凝胶渗透色谱（HPGPC-ELSD）测定获得灵芝多糖的重均相对分子量为91626，并分析其单糖组成以葡萄糖和半乳糖为主。研究成果为进一步开发灵芝多糖并为其进行质量控制提供了技术支持。

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［3］戴军，陈尚卫，朱松，等.不同来源灵芝孢子粉的多糖分子量分布分析与比较［J］.食品与机械，2010，26（1）:12-14.

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［5］王赛贞，林树钱，林志彬，等.高效凝胶渗透色谱法测定双灵固本散中多糖肽的分子量及其分布［J］.海峡药学，2006，18（5）:57-59.

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Determination of Molecular Weight of Ganoderma Lucidum Polysaccharides and Its Monosaccharides Components Analysis

YE Su-dan
（Zhejiang Economic and Trade Polytechnic，Hangzhou，Zhejiang 310018，China）

Ganoderma lucidum polysaccharides（GLP）have a variety of pharmacological activities.Due to its wide sources，GLP obtains different physical and chemical properties，molecular weight，and chemical structural.In this paper，HPLC gel permeation chromatography（HPGPC-ELSD）was utilized for analyzing molecular weight and distribution of a purified GLP prepared from conventional techniques.Meanwhile，its monosaccharide components were analyzed by GC.Results suggested that the molecular weight of the purified GLP was 91.6 kD，monosaccharides components included glucose，galactose，xylose，rhamnose，arabinose and mannose.This study established a scientific rational analysis method for GLP’s physical and chemical properties，and would lead great significance for the development of GLP.

Ganoderma lucidum polysaccharides；molecular weight；monosaccharides components；determination

1006-4184（2015）12-0052-03

2015-07-23

浙江省科技厅分析测试科技计划项目（2013C37087）。

叶素丹（1979-），女，教授，主要从事农产品（食品）安全检测。E-mail:suda2008@163.com。