蠲痹汤对类风湿关节炎大鼠模型细胞因子的影响

俞琦　蔡琨　王文佳

【摘要】目的：观察蠲痹汤对类风湿关节炎大鼠关节炎指数（AI）、血清细胞因子TNF-α、IL-1β、IL-4、IL-10水平的影响，探讨蠲痹汤治疗类风湿关节炎的免疫机制。方法：将大鼠随机分为正常对照组、模型对照组、甲氨喋呤对照组、蠲痹汤高/低剂量组，制备类风湿关节炎大鼠模型，给药组以不同剂量蠲痹汤灌胃，对照组代以生理盐水，检测AI、血清细胞因子TNF-α、IL-1β、IL-4、IL-10的表达。结果：与正常对照组比较，模型对照组大鼠血清TNF-α、IL-1β水平明显上升，IL-10、IL-4水平明显下降（P<001）；与模型对照组比较，蠲痹汤高、低剂量均能明显降低实验大鼠AI和血清TNF-α、IL-1β水平（P<005或P<001），对IL-4水平无影响（P>005），蠲痹汤高剂量组能显著升高模型大鼠IL-10水平（P<001）。结论：蠲痹汤对类风湿关节炎模型大鼠TNF-α等炎症因子具有干预作用，提示蠲痹汤可通过抑制炎性细胞因子TNF-α、IL-1的表达，促进抗炎细胞因子IL-10的分泌，从而达到治疗RA的效果。

【关键词】蠲痹汤；类风湿关节炎；大鼠模型；细胞因子

【中图分类号】R2855【文献标志码】 A【文章编号】1007-8517（2015）14-0001-02

类风湿关节炎（rheumatoid arthritis，RA）属难治性疾病，临床多采用化学药物或生物制剂进行治疗，但疗效不稳定。蠲痹汤出自清代程国彭所著《医学心悟》，由独活、桂心、秦艽、当归、川芎、炙甘草、海风藤、桑枝、乳香、木香组成，具有祛风除湿、益气活血、蠲痹止痛等功效，是临床治疗类风湿关节炎的常用方剂，疗效显著[1-3]。为探讨其作用机制，本研究通过制备类风湿关节炎大鼠模型，以血清细胞因子为观察指标，观察蠲痹汤对类风湿关节炎的免疫调节作用，为进一步研究蠲痹汤治疗类风湿关节炎的作用机制提供实验依据。

1材料与方法

11实验动物Wistar大鼠50只（180±20）g（雌雄分笼），由贵阳医学院实验动物中心提供[许可证号：SCXK（黔）2002-0001]。

12药材与试剂蠲痹汤：按原方比例常规方法制备水煎剂，调整浓度为01g生药/ml，滤过除菌，置4℃备用；甲氨喋呤（上海华联制药有限公司）；完全福氏佐剂（Sigma公司）；大鼠细胞因子TNF-α、IL-1β、IL-10、IL-4检测试剂盒（上海拜力生物科技有限公司）。

13仪器EIX808U型全自动酶标仪（美国BioTek）。

2实验方法

21动物分组动物购回适应性饲养1周后，随机分为2组。正常对照组大鼠10只；模型组大鼠40只，造模后又随机分为模型对照组、甲氨喋呤对照组、蠲痹汤高剂量组、蠲痹汤低剂量组，每组10只。

22大鼠类风湿关节炎模型的制备[4]模型组大鼠左后足跖皮内注射完全福氏佐剂，01ml/只，建立佐剂性类风湿关节炎大鼠病理模型。

23给药方法造模后第7d，甲氨喋呤对照组按12mg/kg灌服，1次/d，连续2周；蠲痹汤高、低剂量组分别按22g/kg、11g/kg灌服，1次/d；正常对照组和模型对照组灌服等量生理盐水，每天一次，连续给药2周。

24关节炎指数（arthritis index，AI）的计算[5]大鼠致炎后第12d开始观察并记录关节病变程度，每4d1次，病变按5级分法评价，根据未注射佐剂的余下肢体的病变程度累计积分，计算出AI。0分：无红肿；1分：小趾关节红肿；2分：趾关节和足趾肿胀；3分：踝关节以下的足爪肿胀；4分：包括踝关节在内的全部足爪肿胀。把各个关节的积分累计起来，即为每只大鼠的AI。

25指标检测末次灌胃12h后开始禁食（不禁水），24h后股静脉取血，分离血清，细胞因子TNF-α、IL-1β、IL-4、IL-10水平的检测均按试剂盒说明书操作。

26统计分析数据分析采用SPSS170软件进行，计量资料以均数±标准差（x±s）表示，组间比较采用t检验，P<005表示差异有统计学意义。

3结果

31对类风湿关节炎大鼠关节炎指数的影响由表1可知，致炎后16d，蠲痹汤高剂量组大鼠关节炎指数显著低于模型对照组（P<005）；致炎后20d，蠲痹汤高、低剂量组大鼠关节炎指数均较模型对照组明显降低（P<005）；从致炎16d起，蠲痹汤高、低剂量组关节炎指数与甲氨喋呤对照组近似，无统计学差异（P>005）。

32对类风湿关节炎大鼠血清细胞因子水平的影响由表2可知，与正常对照组比较，模型对照组大鼠血清细胞因子TNF-α、IL-1β水平明显上升，IL-10、IL-4水平明显下降，差异有统计学意义（P<001）；与模型对照组比较，蠲痹汤高、低剂量组均能明显降低RA模型大鼠血清TNF-α、IL-1β水平（P<001或P<005），对IL-4水平均无影响（P>005）。蠲痹汤高剂量组能显著升高模型大鼠IL-10水平（P<001）。

4讨论

类风湿关节炎（rheumatoid arthritis，RA）是一种累及周围关节为主的多系统性自身免疫性疾病，属于中医学“痹证”范畴。多因风寒湿热等外邪侵袭人体，闭阻经络，气血运行不畅所致。本病较为常见，且是顽固的慢性关节炎症性病变，常侵犯四肢小关节，可引起全身的关节肿胀疼痛及功能障碍，并可伴有关节外的系统性损害，是致残性疾病之一。临床上多采用化学药物或生物制剂进行治疗，但其毒副作用明显、患者难以长期耐受，且疗效不稳定。近年来，用中医中药辨证治疗类风湿关节炎取得很好疗效。蠲痹汤源自《医学心悟》，由独活、桂心、秦艽、当归、川芎、炙甘草、海风藤、桑枝、乳香、木香组成，是治疗类风湿关节炎常用方剂，疗效显著。

研究表明，在RA的发病过程中，细胞因子的失调占有重要的地位，TNF-α、IL-1β主要由单核细胞及巨噬细胞分泌，使外周血和关节滑液中IL-1β和TNF-α升高。IL-1β和TNF-α是炎症、组织损伤及免疫反应的主要介质，在RA的发病机理中居中心地位，参与RA的发生发展过程，二者相互协调、促进，在多数情况下表现协同性生物学效应[6]。表达的IL-1β和TNF-α可刺激滑膜细胞和软骨细胞产生基质金属酶、胶原酶等，导致滑膜炎症和软骨破坏，同时可激活破骨细胞，使骨质溶解[7]。IL-4和IL-10是两种抗炎症的Th2型细胞因子，可负调节抗原提呈细胞的功能，抑制Th1增生，抑制IL-1β、TNF-α和其他一些炎症性细胞因子的功能和生成。IL-10、IL-4在RA病变中含量明显降低。实验和临床观察证实，纠正促炎症细胞因子和抗炎症细胞因子的平衡失调状态，可以缓解或阻止关节炎症的发生和发展[8]。

本研究结果显示，致炎20d后，与模型对照组比较，蠲痹汤高、低剂量均能显著降低实验大鼠关节炎指数（P<005）；从致炎16d起，蠲痹汤高、低剂量组关节炎指数与甲氨喋呤对照组近似，无统计学差异（P>005），表明蠲痹汤能抑制大鼠RA的继发病变。与正常对照组比较，模型对照组大鼠血清TNF-α、IL-1β水平明显升高，IL-10、IL-4水平明显降低（P<001），提示模型大鼠淋巴细胞免疫功能下降，炎性细胞因子分泌增多，抗炎性细胞因子减少，促进了RA的发生发展。与模型对照组比较，蠲痹汤高、低剂量能明显降低实验大鼠血清TNF-α、IL-1β水平（P<001或P<005），蠲痹汤高剂量组能显著升高模型大鼠IL-10水平（P<001），说明蠲痹汤在一定剂量下对类风湿关节炎大鼠模型的免疫功能及紊乱的细胞因子具有调节作用，提示蠲痹汤可通过抑制炎性细胞因子TNF-α、IL-1β的表达，促进抗炎细胞因子IL-10的分泌，从而达到治疗RA的效果。经蠲痹汤治疗后，模型动物IL-4水平不发生变化，提示其不能调节IL-4的表达。

佐剂性关节炎动物模型与人类RA有较高的相似度，利用该模型对RA治疗药物筛选具有重要的应用价值。本实验采用佐剂性关节炎症动物模型进行研究的结果表明：蠲痹汤对佐剂性关节炎大鼠足关节病变有显著抑制作用，其临床治疗类风湿关节炎的机制可能与其调节炎性细胞因子的产生、调节机体免疫有关。

参考文献

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[7] Miossec P1，van den Berg W.Th1/Th2 cytokine balance in arthritis[J].Arthritis Rheum，1997，40（12）：2105-15.

[8] Neurath MF，Hildner K，Becker C，et al.Methotrexate specifically modulates cytokine production by T cells and macrophages in murine collagen-induced arthritis （CIA）： a mechanism for methotrexate-mediated immunosuppression[J].Clin Exp Immunol 1999，115（1）：42-55.

（收稿日期：2015415）