一例猪圆环病毒2型与猪肺炎支原体混合感染的诊断

（辽宁省营口市动物疫病预防控制中心，辽宁营口115000）

（辽宁省营口市动物疫病预防控制中心，辽宁营口115000）

辽宁营口某猪场发生猪消瘦、呼吸系统疾病甚至死亡的疫情。采集病料提取病变组织总DNA或RNA进行猪繁殖与呼吸综合征病毒、猪圆环病毒2型、猪细小病毒、猪伪狂犬病病毒、猪瘟病毒、猪肺炎支原体的PCR或RT-PCR检测。PCR扩增出353 bp的猪圆环病毒2型特异性条带和670 bp的猪支原体肺炎特异性条带。诊断为猪圆环病毒2型和猪肺炎支原体混合感染。

猪圈环病毒2型；猪肺炎支原体；混合感染；PCR；诊断

2013年12月，辽宁省营口市某猪场部分断奶猪和育肥猪生长缓慢、体温升高、呼吸困难、消瘦等主要特征的传染病。具体症状为精神沉郁，体温为40～41℃，双耳及四肢末端发绀，妊娠母猪流产，仔猪呼吸困难，育肥猪清晨和傍晚出现咳嗽现象，眼结膜炎，眼睑水肿，有呼吸道症状，后躯无力，共济失调。新生仔猪发生死亡，伴有呕吐、腹泻及发抖，震颤和运动失调等神经症状。根据症状，初步怀疑为猪繁殖与呼吸综合征病毒（PRRSV）、猪圆环病毒2型（PCV2）、猪细小病毒（PPV）、猪伪狂犬病病毒（PRV）、猪瘟病毒（CSFV）、猪肺炎支原体（Mhp）一种或者几种混合感染。

采集病死猪及病危猪的心脏、肝脏、脾脏、肺脏、肾脏等病料进行猪繁殖与呼吸综合征病毒（PRRSV）、猪圆环病毒2型（PCV2）、猪细小病毒（PPV）、猪伪狂犬病病毒（PRV）、猪瘟病毒（CSFV）、猪肺炎支原体（Mhp）的PCR或RT-PCR检测。

1 材料与方法

1.1 样品的采集辽宁省营口市某养猪场送检猪的心脏、肝脏、脾脏、肺脏、肾脏、血清等病料共10份。

1.2 培养基TSA固体培养基，含5%小牛血清和0.5%NAD。

1.3 主要酶和试剂RNA反转录酶、Taq DNA聚合酶、dNTPs、DNA Marker购自TaKaRa公司；琼脂糖凝胶电泳染色剂Goldview购自赛百盛生物公司；蛋白酶K、SDS、Trizol试剂购自欣经科化学试剂公司；苯酚、氯仿、异戊醇及常用化学试剂购自北京市化学试剂公司；生化鉴定试剂盒购白杭州天和微生物试剂有限公司；管式液体样品病毒DNAout试剂盒购自TIANDZ公司。

1.4 引物参考岳丰雄设计引物[1（]见表1），引物由上海Invitrogen合成，用高压灭菌ddH2O溶解配成10 pmol/L，-20℃保存备用。

表1 引物设计Table1 Primer Design

1. 5PRRSV和CSFV的RT-PCR检测

1.5.1 病毒总RNA的提取病毒总RNA的提取按Trizol试剂使用说明书提取样品总RNA进行，室温自然干燥，加入适量DEPC处理过的水溶解沉淀，待RNA沉淀完全溶解后，-20℃保存备用。

1.5.2 RT-PCR反转录反应按Promega公司的使用说明书进行：取总RNA 7μL，加入20 μL反转录体系中，包括4 μL反转录溶液（50 mmol/L，pH 8.3 Tris-HCl。75 mmol/L KCl，3 mmol/L MgCl2，10 mmol/I DTT），6 μL dNTPs，1 μL OligodT引物（50 pmol/L），1 μL M-MLV反转录酶（200 U/ μL）和1 μL RNase Inhibitor（40 U/μL），用DEPC水补至20 μL，42℃水浴1 h，70℃10 min，置-20℃备用。PCR反应程序为：94℃预变性5 min；94℃变性45 s，58.6℃（PRRSV）或55.6℃（CSFV）退火1 min，72℃延伸1 min，30个循环；72℃延伸7 min。取5 μL PCR扩增产物于1%琼脂糖凝胶电泳进行鉴定[2]。

1.6 PCV2和PRV的PCR检测

1.6.1 病毒总DNA的提取采用酚氯仿抽提法提取病料中的DNA，室温干燥，加入20μL灭菌ddH2O，-20℃保存备用。

1.6.2 PCV2和PRV的PCR扩增PCR反应程序为：94℃预变性5 min；94℃变性45 s，58.6℃（PCV2）、55℃（PPV）、61℃（PRV）退火1 min，72℃延伸1 min，30个循环；72℃延伸7 min。取5 μL PCR扩增产物于l%琼脂糖凝胶电泳进行鉴定[3]。

1.6.3 Mhp基因组的提取按TIANDZ公司柱式细菌DNAout试剂盒说明书进行。-20℃备用。

PCR反应体系（50 μL）如下：TaKaRa Taq（5 U/ μL）25 μL；10xPCR Buffer（Mg2+Plus）5 μL；dNTP Mixture（各2.5 mM）4 μL；Mhp基因组溶液5 μL；DDW加至50 μL。混匀后放入PCR自动扩增仪中进行扩增，扩增程序为：95℃预变性3 min；95℃变性1 min，60℃退火1 min，72℃延伸1 min，共30个循环：72℃延伸7 min[4]。

2 结果与分析

PCR产物琼脂糖凝胶电泳图见图1。

图1 PCR产物琼脂糖凝胶电泳图Fig.1 Agarose gel electrophoresis of.PCR products

PCR或RT-PCR检测结果表明，PCV2扩增为阳性，片段大小约353 bp；Mhp扩增为阳性，片段大小为670 bp；均与预期相符，其他病毒检测结果均为阴性。

3 讨论

通过对猪场进行流行病学调查，并且结合对病死猪的临床症状及剖检变化进行观察和实验室诊断，最终确诊此次猪场发生的疾病为猪圆环病毒2型和猪支原体肺炎的混合感染。猪圆环病毒2型是断奶仔猪多系统衰竭综合征的主要病原[5]。各种年龄、不同性别的猪都可以感染，但以哺乳期和育成期的猪最易感，病死率可达10%[6]。猪圆环病毒2型及其相关疾病已在全世界范围内发生与流行，它属于一种免疫抑制性疾病[7]，PCV-2主要侵害机体的免疫系统，单核细胞和巨噬细胞是PCV-2的靶细胞，可以造成机体的免疫抑制[8-9]。

猪支原体肺炎属于猪的一种高发慢性呼吸道传染病，主要症状为气喘，主要病理变化为肺脏的肉变、胰变，病变呈对称性分布。此病在畜牧业发达的国家普遍流行，同时也广泛存在于世界各国，在我国也属养猪业的主要接触性传染病之一。如若诊治不及时甚至可能造成死亡，也可继发其他病原体感染，包括猪繁殖与呼吸综合征病毒（PRRSV）、猪圆环病毒2型（PCV2）、伪狂犬病毒（ADV）以及猪流感病毒（SIV）。多病原混合感染导致产生所谓的猪呼吸系统疾病综合征（porcine respiratorydisease complex，PRDC）[10]。本病例可能为圆环病毒2型引发猪免疫能力下降，导致继发猪支原体肺炎。

PCR扩增是一种快速、特异、易于操作、广泛应用于实验室的检测方法。本次发病在临床初步诊断的基础上，采用PCR方法进行了实验室诊断，从而确定有猪圆环病毒2型和猪肺炎支原体感染，确诊为猪圆环病毒2型、猪肺炎支原体混合感染。

针对该病例的诊断，猪场应该加强管理，及时隔离病患猪只，阻断疾病蔓延，改善饲养条件，提高猪只的免疫力，饲养技术专业化，尽量做到自繁自养，合理用药，不滥用抗生素，建立准入和淘汰制度，维护健康猪群[11]。

[1]岳丰雄.鉴别PCV2、PPV、PRV、PRRSV、CSFV多重PCR诊断方法的建立及初步应用[D].乌鲁木齐：新疆农业大学，2008.

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[4]丁敏.实时荧光PCR技术检测猪肺炎支原体研究[D].北京：中国农业科学院，2008.

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[9]陈溥言.兽医传染病学[M].5版.北京：中国农业出版社，2007：231-234.

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[11]赵东升，刘有昌，李祥健，等.猪肺炎支原体与其他病原的相互作用[J].养猪，2008，（5）：66-68.

（编辑：张婷婷）

一例猪圆环病毒2型与猪肺炎支原体混合感染的诊断

谷建

Diagnosis of mixed infection of porcine circovirus 2 and mycoplasma hyopneumoniae

Gu Jian

（Yingkou city animal disease prevention and control center,LiaoningYingkou115000）

A pig farm in Yingkou broke out disease which caused swine weight loss,disease of respiratory system,even death.Samples of diseased pigs were collected.Total DNA and RNA of the sampleswereextracted.Porcinereproductiveandrespiratorysyndromevirus(PRRSV),porcine circovirus type 2(PCV2),classic swine fever virus(CSFV),pseudorabies virus(PRV),porcine parvovirus(PPV)and mycoplasma hyopneumoniae(Mhp),were detected by PCR or RT-PCR.A 353 bp production which correspond to porcine circovirus type 2 was amplified and a 670 bp production which correspond to mycoplasma hyopneumoniae was amplified.Finally,the diagnosis was a mixed infection of PCV2 with MHP.

Porcine circovirus type 2;Mycoplasma hyopneumoniae;Mixed infection;PCR;Diagnosis

S858.28文献标识码：A文章编号：1672-9692(2015)01-0040-04

2014-11-24

谷建（1983-），男，兽医师，硕士，主要从事动物疫病防控与检测工作。

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