牛、羊布鲁氏菌病试管凝集试验与微量凝集试验检测方法的比较

赵凤菊，李璐，闫明媚，于学武，陈瑶，李井春

（辽宁省动物疫病预防控制中心，辽宁沈阳110164）

牛、羊布鲁氏菌病试管凝集试验与微量凝集试验检测方法的比较

赵凤菊，李璐，闫明媚，于学武，陈瑶，李井春

（辽宁省动物疫病预防控制中心，辽宁沈阳110164）

血清学检测方法因其快速、安全、高效等特点被广泛应用于布鲁氏菌病的检测和诊断。本文通过对保存的226份牛、羊血清样品同时使用试管凝集法与微量凝集试验进行检测并比较分析其在诊断中的意义。结果显示，微量法与试管法两者的符合率为97.79%，两种检测方法无统计学差异。但微量法的阳性检出率要高于试管法，同时由于微量法具有操作简便、快捷及结果判定更为直观、简单等优点，因此，微量凝集试验更适宜在我国基层布鲁氏菌病大量样本监测、诊断中推广应用。

布鲁氏菌病；试管凝集试验；微量凝集试验

布鲁氏菌病（Brucellosis）简称布病，是由布鲁氏菌属（Brucella）细菌引起的动物源性人兽共患传染病[1-2]，可引起天然宿主网状内皮系统持续性感染[3]。本病多发于家畜中的牛、羊、猪，引起高热、流产等症状，阳性病畜暴露人群有高度的感染风险[4]。该病在全世界分布十分广泛。近年来，随着集约化养殖程度的不断提高，我国2013年全国报告的布病发病率比1993年增加了170倍，2012年畜间布病疫情发生5 404次，涉及19个省[5]。由此可见，布病的防控形势依然严峻，布病不仅严重危害人类健康，还对畜牧业发展和对外贸易造成巨大影响。布病的早期准确诊断是有效治疗和预防的关键环节。目前用于检测的技术有很多，公认比较成熟有效的实验室诊断方法有细菌学诊断技术、PCR技术、凝集试验、补体结合试验、ELISA、荧光偏振试验、乳环试验等。长期以来，在我国动物布病监测中主要采用国标中规定的虎红平板凝集试验（RBPT）、全乳环状试验（MRT）、试管凝集试验（SAT）和补体结合试验（CFT）。其中SAT是我国在动物布病监测、检疫中应用最广的复检方法之一。我国最早于1988年有微量凝集试验检测布病抗体的相关研究的报道[6]。

本文对保存的牛、羊血清同时采用SAT和微量凝集试验进行血清学检测，对比两种检测方法的差异，以鉴定、证实、评价微量凝集试验在布病监测中的实用价值，从而为微量凝集试验能否在动物布病监测工作中应用提供参考依据。

1 材料与方法

1.1 主要试剂布病试管凝集抗原、标准阴性血清及标准阳性血清购自中国兽医药品监察所。0.5%石炭酸生理盐水、0.5%石炭酸的10%盐溶液等其他试剂均由辽宁省动物疫病预防控制中心配制。

1.2 血清样本临床样品为辽宁地区采集的牛、羊血清样品共226份，其中经RBPT、SAT和CFT方法检测均为布病抗体阴性且临床健康牛、羊的血清样品分别为68份、30份；布病抗体检测阳性的牛、羊血清样品分别为80份、48份。

1.3 试验器材96孔U型微量凝集板、三分玻璃试管、十二通道10～100 μL可调微量移液器、单通道2～10 μL可调微量移液器、一次性凝集反应封膜、试管架、振荡器、37℃恒温培养箱。

1.4 试验方法及判定标准

1.4.1 试管凝集试验试验方法及判定标准参照我国《动物布鲁氏菌病诊断技术》（GB/T 18646-2002）。

1.4.2 微量凝集试验试验方法及判定标准。

1.4.2.1 试验方法每份受检血清用4个U型孔。羊血清的稀释时，在第1孔加入184 μL 0.5%石炭酸的10%盐溶液，第2～4孔分别加入100 μL。然后取被检血清16 μL，加入第一孔混匀。再从第1孔吸取100 μL混合液加入第2孔，如此倍比稀释至第4孔，从第4孔弃去混合液100 μL。稀释结束后，从第1至第4孔的血清稀释度分别为1:12.5、1:25、1:50和1:100。牛血清稀释法与上述基本一致，差异是第1孔加192 μL 0.5%石炭酸生理盐水和8 μL被检血清。将100 μL的工作抗原加入已稀释好的各孔中，并振荡混匀，羊的血清稀释则依次变为1:25、1:50、1:100和1:200，牛的血清稀释度则依次变为1:50、1:100、1:200和1:400。用一次性凝集反应封膜封板后，于37℃温箱孵育24 h。每次试验均应设阳性血清、阴性血清和抗原对照。阴性对照血清的稀释和加抗原的方法与受检血清相同。阳性对照血清须稀释到原有滴度，加抗原的方法与受检血清相同。抗原对照：稀释的工作抗原液100 μL，再加100 μL稀释液，观察抗原是否有自凝现象。

1.4.2.2 判定标准凝集反应程度分为5个等级，分别记为“++++”、“+++”、“++”、“+”、“-”，按以下说明判定：++++：菌体完全凝集，1～4孔凝集物呈伞状均匀铺于孔底；+++：菌体几乎完全凝集，1～3孔凝集物呈伞状均匀铺于孔底，第4孔孔底呈现白色点状；++：菌体凝集显著，1～2孔凝集物呈伞状均匀铺于孔底，3～4孔孔底呈现白色点状；+：凝集物有沉淀，第1孔凝集物呈伞状均匀铺于孔底，2～4孔孔底呈现白色点状；-：无凝集，1～4孔孔底均呈现白色点状。

1.4.2.3 结果判定当阳性血清出现完全凝集（++++），而阴性血清无凝集（-），抗原对照无自凝（-）现象时，试验成立，按以下对试验结果判定：受检血清出现“++”及以上凝集现象时，判定为阳性（+）。受检血清出现“+”凝集现象时，判定为可疑（±）。受检血清出现“-”时，判定为阴性（-）。

1.4.3 统计分析方法试验结果使用Excel进行录入，对SAT和微量凝集试验结果应用SPSS 17.0软件进行统计学分析。

2 结果与分析

用上述方法对148份牛血清、78份羊血清样品同时进行SAT和微量凝集试验，利用SPSS 17.0软件对SAT和微量凝集试验结果进行统计学分析，P＞0.05，Kappa值为0.877，检测结果见表1。通过试验表明两种方法对检测结果完全符合的为221份，占97.79%；SAT检测阴性、微量凝集试验检测阳性的为5份，占2.21%，微量凝集试验的阳性检出率要高于SAT；微量凝集试验高于SAT一个滴度的为16份，占7.08%。

表1 SAT和微量凝集试验检测结果Table1 Indicators of SAT and microscale agglutination test

3 讨论

布鲁氏菌病不仅损害人类健康，影响着包括乳、肉及其制品、皮、毛等在内的民生需求，甚至还影响畜牧业发展乃至国际贸易和旅游业。尤其是由其引起的人类波状热、慢性感染以及反刍动物流产和睾丸炎，至今尚无法根治。因此，定期对动物间布病的监测仍是有效预防、控制本病的关键。

虽然目前已有较多先进的检测方法可以用于本病的检测诊断，但由于因条件所限，SAT在我国基层仍为本病主要检验方法。而SAT方法由于血清用量大、所用耗材多、操作繁琐、结果判定受主观因素影响较大，因此不适于大量样本的监测。本文利用SPSS 17.0软件对SAT和微量凝集试验结果进行统计学分析，表明这两种试验方法在统计学上无显著差异。Kappa值作为评价试验可靠性指标之一，Kappa值越接近1.0，表明试验的可靠性越高。若Kappa值＞0.6，则表示一致性相当可靠。本文通过利用SPSS 17.0软件对试验结果进行Kappa值分析，表明这两种检测方法具有很高的一致性。同时，微量凝集试验的阳性检出率要高于SAT，而布病抗体检测阴性且临床健康牛、羊的血清样品中未出现微量凝集试验阳性。由此可见，微量凝集试验检测方法的应用可以有效的避免出现漏检、误检现象的出现，可以在最短的时间内将布鲁氏菌病阳性动物筛选出来，防止疫情扩散、蔓延，有效减少动物布鲁氏菌病感染人类的机会。

微量凝集试验不仅操作更为方便、快捷，有效节约了血清样品与试剂的用量，而且也克服了SAT在结果判定过程中主观因素的影响，使得结果判定更为客观、简便、直观，更适宜在基层推广、应用。因此，微量凝集试验对大规模动物检测应用、进出口动物及其产品检验检疫把关、食品安全监控以及畜牧业疫病防控均有重要意义。

[1]孙志华，刘良波，张预，等.布鲁氏菌外膜蛋白VirB4在感染胚胎滋养层细胞中的作用分析[J].中国人兽共患病学报，2014，30（10）：990-996.

[2]庞峰，贾晓晓，赵天靖，等.羊种布鲁氏菌Wzt基因的克隆及原核表达[J].中国畜牧兽医，2014，41（11）：54-57.

[3]Al Dahouk S,Fleche PL,Nockler K,et al, Evaluation ofBrucellaMLVA typing for human brucellosis[J].JMicrobiolMethods,2007, 69:137-145.

[4]訾占超，亢文华，马英，等.荧光偏振技术在布鲁氏菌病检测中的应用[J].中国人兽共患病学报，2014，30（10）：1057-1061，1065.

[5]崔步云.中国布鲁氏菌病疫情形势与研究进展[A].第四届全国人畜共患病学术研讨会[C].2014年中国狂犬病年会中国畜牧兽医学会兽医公共卫生学分会第四次学术研讨会论文集，2014，53.

[6]张双宅.布鲁氏菌微量凝集试验的建立[J].医学动物防制，2012，28（4）：399-400.

（编辑：张婷婷）

Comparison of serum tube agglutination test and micro agglutination test on brucellosis detection in cattle,goat and sheep

Zhao Fengju,Li Lu,Yan Mingmei,Yu Xuewu,Chen Yao,Li Jingchun

（Animal Epidemic Diseases Control and Prevention Center of Liaoning Province,Shenyang110164）

Serologic tests were widely used in the detection and diagnosis of brucellosis,because of its fast,safe,efficient,and other characteristics.In order to compare and analyze its significance in diagnosis,a total of 226 cattle,goat,and sheep serum samples were detected by both tube agglutination and micro agglutination test at the same time in this study.The results showed that the coincidence rate of the tube agglutination test and micro agglutination test was 97.79%;and there was no significant difference in two methods.However,the positive rate of micro agglutination test was higher than tube agglutination test.Micro agglutination test was more suitable for brucellosis surveillance and diagnosis,for it was a simple,fast and more intuitive diagnosis method.

Brucellosis;Tube agglutination test;Micro agglutination test

S858.23文献标识码：B文章编号：1672-9692(2015)02-0008-03

2015-01-04

赵凤菊（1978-），女，硕士，高级兽医师，主要从事动物疫病防控工作。

辽宁省农业攻关支撑计划，编号：201404210