酸模叶蓼类黄酮对小鼠生长、免疫和抗氧化性能的影响

朱宇旌，李艳，于治姣，张勇⋆

（1.沈阳农业大学畜牧兽医学院，辽宁沈阳110866；2.青岛正大猪业有限公司，山东青岛266000；3.沈阳艾德蒙种猪繁育有限公司，辽宁沈阳110171）

酸模叶蓼类黄酮对小鼠生长、免疫和抗氧化性能的影响

朱宇旌1，李艳2，于治姣3，张勇1⋆

（1.沈阳农业大学畜牧兽医学院，辽宁沈阳110866；2.青岛正大猪业有限公司，山东青岛266000；3.沈阳艾德蒙种猪繁育有限公司，辽宁沈阳110171）

本试验以研究酸模叶蓼类黄酮的营养免疫功能为目的，选用36只清洁级昆明小鼠，分为4组，每组3个平行处理。分别进行对照组（0 mg/kg)、低剂量组（30 mg/kg)、中剂量组（100 mg/kg)和高剂量组（300 mg/kg）的酸模叶蓼类黄酮灌胃处理，进行生长性能、免疫性能和抗氧化性能指标测试。结果显示，低剂量酸模叶蓼类黄酮处理可促进小鼠的生长，与对照组相比，试验组T4水平呈显著性增加（P＜0.05），中剂量酸模叶蓼类黄酮处理极显著提高HGH分泌水平（P＜0.01）；低剂量酸模叶蓼类黄酮处理显著提高脾脏指数（P＜0.05），高剂量酸模叶蓼类黄酮处理显著提高巨噬细胞吞噬率（P＜0.05），中剂量与高剂量酸模叶蓼类黄酮处理分别显著（P＜0.05）和极显著（P＜0.01）提高半数溶血值，中剂量组酸模叶蓼类黄酮处理对T淋巴细胞转化率有显著的提高作用（P＜0.05），各剂量酸模叶蓼类黄酮处理均极显著提高小鼠迟发性变态反应右耳增厚值（P＜0.01）；低剂量与中剂量酸模叶蓼类黄酮处理显著提高血清GSH-Px活性（P＜0.05）。中剂量酸模叶蓼类黄酮处理提高SOD值和降低MDA含量的效果最好，高剂量酸模叶蓼类黄酮处理提高T-AOC水平的作用最好。

酸模叶蓼；类黄酮；生长性能；免疫性能；抗氧化性能

生物类类黄酮（bioflavonoids）是一种广泛存在于自然界中的酚类物质，又称维生素P，常与维生素C伴随存在，是植物光合作用产生的一类重要的天然有机化合物。类类黄酮是自然界药用植物中主要的活性成分之一，具有调节血脂、消除氧自由基、抗氧化、抗肿瘤[1]、抗病毒、调节内分泌和增强免疫[2]等生理活性。

酸模叶蓼（Polygonum lapathifolium）别名旱苗蓼、大马蓼、柳叶蓉等，为一年生双子叶杂草。Keles O等[3]对酸模叶蓼的药用价值进行了评估，结果表明酸模叶蓼提取物具有抗炎和解热活性；Takasaki等[4]经过研究发现酸模叶蓼提取物对小鼠皮肤肿瘤具有显著的预制作用；Smolarz等[5]从酸模叶蓼中提取出乔松酮——一种具有抗败血作用的类黄酮。本试验研究分析酸模叶蓼类黄酮对小鼠生长性能指标：日采食量、日增重、三碘甲状腺氨酸（liothyronine，T3）、甲状腺素（thyroxine，T4）、生长激素（human growth hormone，HGH），免疫性能指标：免疫器官系数、巨噬细胞吞噬功能、血清溶血素、迟发型变态反应、T淋巴细胞转化率和抗氧化性能指标：超氧化物歧化酶（superoxide dismutase，SOD）、总抗氧化能力（Total antioxidant capacity，T-AOC）、谷胱甘肽过氧物酶（glutathione peroxidase，GSH-Px）和丙二醛（malondialdehyde，MDA）的影响，以期为绿色饲料添加剂的开发和酸模叶蓼资源的合理利用提供理论依据。

1 材料与方法

1.1 试验材料纯度为71%的酸模叶蓼类黄酮提取物，由本实验室从酸模叶蓼全草中经超声波辅助乙醇提取法提取，大孔吸附树脂分离纯化得到。提取物溶解于0.5%羧甲基纤维素钠（CMC-Na）配制成所需浓度的溶液。

1.2 试验动物的分组及处理选用36只20±2 g SPF雄性小鼠，随机分成4组，分别为对照组（0 mg/kg）、低剂量组（30 mg/kg)、中剂量组（100 mg/ kg）和高剂量组（300 mg/kg），每组3个平行。预饲期为7 d，试验期21 d。将酸模叶蓼类黄酮提取物溶解于0.5%的羧甲基纤维素钠（CMC-Na）配制成一定浓度的溶液。每天定时灌胃，对照组灌胃0.2 mL 0.5%CMC-Na溶液，试验组分别灌胃0.2 mL不同浓度的酸模叶蓼类黄酮CMC-Na溶液。整个试验期所有小鼠饲喂同一饲料，自由采食和饮水。定期称量小鼠体重和采食量，适时配制适宜浓度的溶液。每天观察小鼠的情况，如精神状态、活动情况和进食情况等。

1.3 检测指标与方法

1.3.1 生长性能指标和免疫器官系数试验前后分别称量小鼠体重，计算日增重；每天称量，记录小鼠的采食量；饲喂试验结束后对小鼠进行眼球后静脉丛毛细血管采血，将血液3 000 r/min离心10 min，取血清备用。颈椎脱臼处死小鼠，立刻解剖取胸腺和脾脏，去除筋膜和脂肪，用滤纸吸去多余水分后称重，计算其占体重末重的比例。

1.3.2 T3、T4和HGH水平的测定取小鼠离心后的血清，分别按照三碘甲状腺原氨酸放免试剂盒、甲状腺素放免试剂盒及血清生长激素放免测定盒（均购于北京华英生物技术研究所）说明进行操作，采用放射免疫分析方法测定生长类激素的水平。

1.3.3 巨噬细胞吞噬功能采用小鼠腹腔巨噬细胞吞噬鸡红细胞的方法。最后一次灌胃后，分别向所有的对照组和剂量组小鼠的腹腔注射0.5 mL 1%鸡血红细胞悬浮液，1～12 h后颈椎脱臼处死。腹腔注射2 mL生理盐水并且不时揉动，10 min后取一定量腹腔液制片。油镜下观察腹腔巨噬细胞吞噬鸡血红细胞的现象，计数100个巨噬细胞中吞噬有鸡红细胞（chicken red blood cell，CRBC）的巨噬细胞个数，计算巨噬细胞吞噬率。

1.3.4 血清溶血素的测定采用半数溶血值法。试验期第16天向小鼠腹腔注射鸡红细胞悬液，试验结束后眼球采血取血清测定。

1.3.5 二硝基氯苯（DNCB）诱导小鼠迟发性变态反应（DTH）的测定采用耳肿胀法。试验期第14天用20 μL的7%的二硝基氯苯丙酮溶液对小鼠颈背部致敏，第20天用20 μL 7%的二硝基氯苯丙酮溶液攻击右耳两侧，16 h后测量两耳厚度，计算比较差值。

1.3.6 T淋巴细胞转化率的测定采用瑞氏染色法。试验期第19天各组小鼠每只肌肉注射植物血凝素0.4 mg/d，连续2 d。试验期最后1 d尾部静脉取血推片，自然风干。瑞氏染色，油镜下计数100～200个淋巴细胞，计算T淋巴细胞的转化率。

1.3.7 抗氧化性能指标SOD、T-AOC、GSH-Px和MDA的测定SOD采用黄嘌呤氧化酶法测定，T-AOC采用双抗体两步夹心酶联免疫吸附法测定，GSH-Px采用二硫代二硝基苯甲酸法测定，MDA采用硫代巴比妥酸法测定。取小鼠血清按照各试剂盒（均购于北京华英生物技术研究所）要求进行检测。

1.4 数据统计分析采用SPSS statistics 17.0统计软件处理数据，试验数据通过方差分析法进行显著性检验，差异显著时按照duncan及新复极差法进行多重比较。检测水准为α=0.05（显著水平）或α=0.0（极显著水平）。

2 结果与分析

2.1 酸模叶蓼类黄酮对小鼠生长性能的影响

2.1.1 酸模叶蓼类黄酮对小鼠生长指标的影响见表1。

由表1可知，与对照组相比，酸模叶蓼类黄酮的低、中、高3个剂量组对小鼠的日采食量均有提高作用，其中低剂量的作用最大，较其提高了11.18%，但差异未达到显著水平（P＞0.05）；低剂量组的酸模叶蓼类黄酮对雄性小鼠的日增重有提高作用，而中剂量和高剂量与对照组相比反而有下降趋势，但各组间差异均不显著（P＞0.05）。

表1 酸模叶蓼类黄酮对雄性小鼠生长指标的影响Table1 Effects of polygonum lapathifolium flavonoids on growth index in male mice

2.1.2 酸模叶蓼类黄酮对小鼠生长激素分泌的影响见表2。

表2 酸模叶蓼类黄酮对小鼠生长激素分泌的影响Table2 Effects of polygonum lapathifolium flavonoids on growth hormone in male mice

由表2可知，酸模叶蓼类黄酮对小鼠生长激素的分泌有一定的影响。随着添加量的增加，T3水平较对照组略有增加，但差异不显著（P＞0.05）；各剂量组的T4水平均呈显著性增加（P＜0.05）；与对照组相比各剂量组的HGH水平均有增加，中剂量组较其提高了33.84%，差异达到极显著（P＜0.01），高剂量组次之，较其提高了27.19%，差异显著（P＜0.05）。

2.2 酸模叶蓼类黄酮对小鼠免疫性能的影响

2.2.1 酸模叶蓼类黄酮对小鼠免疫器官重的影响见表3。

表3 酸模叶蓼类黄酮对小鼠免疫器官重的影响Table3 Effects of polygonum lapathifolium flavonoids on spleen index and hymus index in mice

由表3可知，各处理组的脾脏指数和胸腺指数均高于对照组，其中低剂量组脾脏系数最高，比对照组提高了7.85%，差异达到显著水平（P＜0.05）；胸腺指数各剂量组与对照组差异均不显著，其中低、中剂量组胸腺指数均高于对照组，低剂量组较对照组提高了5.02%，而高剂量组胸腺指数反而低于对照组。可见酸模叶蓼类黄酮对小鼠的脾脏、胸腺都有一定的刺激增生作用。

2.2.2 酸模叶蓼类黄酮对小鼠免疫功能的影响为考察酸模叶蓼类黄酮对小鼠免疫功能的影响，分别测定了小鼠巨噬细胞吞噬率、半数溶血值、迟发型变态反应及T淋巴细胞转化率。见表4。

表4 酸模叶蓼类黄酮对小鼠免疫功能的影响Table4 Effects of polygonum lapathifolium flavonoids on immune function in mice

由表4可知，酸模叶蓼类黄酮对小鼠巨噬细胞吞噬功能有提高的作用，随着类黄酮剂量的增加，巨噬细胞吞噬率呈增长趋势，其中与对照组的差异达到了显著水平（P＜0.05）。

小鼠的半数溶血值随着类黄酮用量的增加而呈增长趋势。其中中剂量组与对照组相比差异显著（P＜0.05），提高12.6%；高剂量组与对照组和低剂量组相比差异均达到极显著（P＜0.01），分别提高21.8%和18.8%。

灌胃酸模叶蓼类黄酮后，各剂量组小鼠的右耳均明显增厚。与对照组相比差异均达到极显著水平（P＜0.01），其中以中剂量组效果最好。说明酸模叶蓼类黄酮对小鼠的迟发型变态反应有明显促进作用。

灌喂酸模叶蓼类黄酮可以促进小鼠T淋巴细胞转化率的提高，其中中剂量组最高，与对照组相比差异达到显著水平（P＜0.05），较其提高了11%。

2.3 酸模叶蓼类黄酮对小鼠抗氧化性能的影响见表5。

由表5可知，低、中剂量组的血清GSH-Px活性显著高于对照组（P＜0.05），而高剂量组与对照组相近。

与对照组比较，小鼠的血清SOD值呈现先升高后降低的趋势，但各组与对照组的差异均不显著（P＞0.05）。

各剂量组血清MDA的含量均低于对照组，其中中剂量组效果最为明显，降低了16.44%，但各组与对照组的差异均未达到显著水平（P＞0.05)。

小鼠血清中T-AOC水平均高于对照组，且表现为随添加量的增加而增加的趋势，但与对照组的差异均未达到显著水平（P＞0.05）。

表5 酸模叶蓼类黄酮对小鼠抗氧化性能的影响Table5 Effect of Polygonum lapathifolium flavonoids on antioxidant properties in mice

3 讨论

3.1 酸模叶蓼类黄酮对小鼠生长性能的影响本试验表明酸模叶蓼类黄酮对小鼠生长指标的影响与剂量有关，低剂量组30 mg/kg对小鼠生长指标的促进作用最大，但随着剂量的增加作用效果反而降低。这可能与类黄酮的双重作用相关[6]，每种功能发挥其最佳效果需要一定的剂量，这与赵春燕[7]对沙葱类黄酮的研究结果相近。许兰芝等[8]研究发现淫羊藿总黄酮可以促进大鼠T3、T4的分泌，本试验中剂量组T3、T4含量随着剂量的增加而呈增长趋势，与其研究结果相符，说明酸模叶蓼类黄酮能促进生长激素的分泌。另外经过试验发现，酸模叶蓼类黄酮能促进HGH的分泌，且分泌量与添加剂量相关。

3.2 酸模叶蓼类黄酮对小鼠免疫性能的影响T淋巴细胞是参与细胞免疫的主要细胞，其分化成熟的场所是胸腺；B淋巴细胞是参与体液免疫的主要细胞，是脾脏中主要的免疫细胞[9]。酸模叶蓼类黄酮可以提高小鼠的胸腺和脾脏指数，且增长率与剂量相关，说明其对免疫功能具有促进作用。

巨噬细胞可以迅速吞噬进入机体的异体颗粒，如病毒、异物等，也可以吞噬自身产生的抗原性物质，巨噬细胞的吞噬能力是衡量机体免疫功能的标准之一。本试验中，随着酸模叶蓼类黄酮添加量的增加，小鼠巨噬细胞的吞噬率和半数溶血值不断增加，且与浓度呈正相关作用。阎莉等[10]和高晓雯等[11]的试验分别证明了广西藤茶总黄酮和芫花根总黄酮对小鼠巨噬细胞的吞噬能力及半数溶血值有增强作用，印证了黄酮类物质可以提高机体免疫功能。

迟发型变态反应是公认的测定细胞免疫功能的一种较准确的方法。本试验发现所有灌喂酸模叶蓼类黄酮小鼠的右耳都明显增厚，且与对照组的差异均达到极显著水平（P＜0.01），说明酸模叶蓼类黄酮对小鼠细胞免疫功能具有显著增强作用。T淋巴细胞在机体早期抗感染和细胞内寄生菌感染的免疫功能中发挥着重要的作用，其功能状态可以反映机体细胞免疫功能的水平。韦翠萍等[12]研究发现沙苑子黄酮对小鼠淋巴细胞转化率有显著提高作用，本试验证明酸模叶蓼类黄酮可以提高小鼠淋巴细胞转化率且效果与剂量相关，与其研究结果一致。因此，酸模叶蓼类黄酮可增强小鼠的特异性和非特异性免疫功能。

3.3 酸模叶蓼类黄酮对小鼠抗氧化性能的影响GSH-Px是机体内存在的一种催化H2O2分解的酶，能直接或间接地通过酶反应清除自由基，也可促进其他抗氧化剂的再生。它能特异性催化还原型谷胱甘肽对H2O2的还原反应，可以保护细胞膜结构和功能的完整。GSH-Px缺乏能导致线粒体的损伤，增加活性氧自由基的产生，同时提高由于自由基损伤造成的毒性影响。SOD可以消除机体新陈代谢中产生的有害自由基，是重要的抗氧化酶，在维持细胞膜结构完整性方面发挥着重要的作用。MDA可反映机体内脂质过氧化的程度，其含量与细胞损伤的程度呈正相关，因此，MDA被认为是反映机体脂质过氧化水平的一个间接指标。机体中存在各种抗氧化物，例如抗氧化大分子、小分子和酶等，这些抗氧化物可以清除机体产生的各种活性氧，以阻止氧化应激的产生[13]。T-AOC是对一个体系内各种抗氧化大分子、小分子和酶总体水平的反映。酸模叶蓼类黄酮能提高血清中的SOD、TAOC、GSH-Px水平，降低血清中的MDA水平，说明酸模叶蓼类黄酮化合物在动物机体内有良好的抗氧化作用。

机体新陈代谢过程中会产生一系列的自由基。自由基性质活泼，氧化能力极强，可通过氧化反应破坏细胞膜、线粒体膜，并且与膜中的不饱和脂肪酸发生反应，生成脂质过氧化产物，分解产生更多的自由基，从而引起自由基连锁反应[14]。酸模叶蓼类黄酮可以提高小鼠的抗氧化能力，其机制可能为终止自由基连锁反应，途径可能为类黄酮给H2O2提供氢原子形成类黄酮自由基[15]；还可能是酸模叶蓼类黄酮络合有催化作用的金属离子[16]，抑制自由基形成，减少自由基对不饱和脂肪酸的氧化作用；酸模叶蓼类黄酮还可能减少自由基对机体内蛋白质和总RNA等的损害[14]及对机体新陈代谢的干扰，通过抗氧化作用保护线粒体内过氧化氢酶的活性[17]。

4 结论

综上所述，在机体生长方面，适宜剂量的酸模叶蓼类黄酮能提高小鼠的生长指标，促进HGH的分泌。随着酸模叶蓼类黄酮剂量的增加。小鼠T3、T4的分泌量也呈增长趋势。在机体免疫方面，添加酸模叶蓼类黄酮能够提高小鼠的特异性和非特异性免疫功能。在抗氧化方面，酸模叶蓼类黄酮在提高血清中SOD、T-AOC、GSH-Px水平，降低血清中MDA水平方面都有积极作用。这为酸模叶蓼类黄酮作为饲料添加剂的开发提供了科学依据。

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（编辑：郭雪峰）

Effect of Polygonum Lapathifolium Flavonoids on Growth、Immunity Performance and Antioxidant Properties of Mice

Zhu Yujing1,Li Yan2,Yu Zhijiao1,Zhang Yong1*

（1.College of Animal Science and Veterinary Shenyang Agricultural University,LiaoningShenyang110866；2.Qingdao Chia Tai pig industry Company Limited,ShandongQingdao266000; 3.Shenyang Edmund swine breeding co.,LTD,LiaoningShenyang110171）

The present research studied the functions of flavonoids from Polygonum lapathifolium.The 36 SPF mice were divided into 4 groups and were given Polygonum lapathifolium flavonoids at dosages of 30,100,300 mg/kg,and the performance of growth,immune,oxidation were tested. The results showed that low doses of flavonoids of Polygonum lapathifolium can promote the growth of mice,especially T4 levels of each experimental group were significantly higher than that in the control group(P＜0.05);The middle doses group of Polygonum lapathifolium flavonoids can significantly increase serum HGH levels(P＜0.01);The low doses of Polygonum lapathifolium flavonoids improved the level of spleen index of mice,The macrophage phagocytosis rate of high dosesgroup were significantly higher than that in the control group(P＜0.05),Half hemolysin value of middle dose group and high dose group reached a significant level(P＜0.05)and a significant level(P＜0.01)separately to the control group,Middle dose group of Polygonum lapathifolium flavonoidsverysignificantlyimprovedthelymphocytetransformationrateofmice(P＜0.05),each treatmentgroupofPolygonumlapathifoliumflavonoidsverysignificantlyincreasedrightear thickness increasement(P＜0.01);The low and middle dose group of Polygonum lapathifolium flavonoids can significantly improve the activity of GSH-Px(P＜0.05).The middle dose group of Polygonum lapathifolium is the best to improve the value of SOD and reduce the content of MDA.The high doses group of Polygonum lapathifolium flavonoid play the best effect in improving the level of TAOC.

Polygonum lapathifolium;Flavonoids;Growth;Immunity performance;Antioxidant properties

R285.5文献标识码：B文章编号：1672-9692(2015)02-0001-07

2015-01-07

朱宇旌（1972-），女，博士，副教授，主要从事饲料资源开发利用的研究与教学工作。

张勇（1972-），男，博士，教授，从事猪的营养与饲料资源开发利用方面的教学和研究工作。

国家自然科学基金（31101253；30972112）