真菌SF—21483产生的活性物质分离纯化及初步确认

张亚妮等

摘要：从武汉地区土壤中分离得到一株真菌菌株SF-21483，其发酵液具有较强的抑制真菌的作用。本研究以真菌SF-21483发酵提取物中的活性代谢产物为研究对象，应用高效制备液相色谱经过2次分离纯化，得到了5个化合物。根据紫外吸收光谱、分子离子峰、物理性状及活性情况等确定组分4、5、7、9、10与冬青生菌素（Ilicicolin）F、E、D、C、H较为相似，对植物病原菌生物活性测试表明，该类组分具有较强的抗菌作用。

关键词：真菌菌株SF-21483；农药活性物质；分离；纯化；冬青生菌素（Ilicicolin）

中图分类号：S482.2 文献标识码：A 文章编号：0439-8114（2015）17-4188-04

DOI：10.14088/j.cnki.issn0439-8114.2015.17.020

从微生物中筛选天然物质始于1929年青霉素的发现，自20世纪40年代，至今已发现一万余种抗菌素[1]。微生物在其生长过程中会产生一些初生及次生代谢产物。农用抗生素是微生物产生的次级代谢产物，可用于防治农业有害生物，是一类用途很广泛、 产业化程度很高的生物农药[2]。本研究在武汉某地土样中分离得到一株真菌菌株（编号为SF-21483），对SF-21483的发酵提取物进行化学成分的分析，从中分离到5个化合物，研究包括真菌SF-21483的发酵、提取、分离纯化，初步确定其结构及生物学活性。

1 材料与方法

1.1 材料

1.1.1 培养基 种子培养基：麦芽糖6.25 g，麦芽提取物6.25 g，酵母提取物1.00 g，磷酸二氢钾1.25 g，硫酸镁 0.625 g，蛋白胨 0.625 g，琼脂粉15.00 g，去离子水1 000 mL。

摇瓶发酵培养基：葡萄糖 72.00 g，蛋白胨8.00 g，酵母提取物4.00 g，磷酸二氢钾2.00 g，硫酸镁1.00 g，盐酸硫胺0.10 g，pH 6.0，去离子水1 000 mL。

1.1.2 主要仪器 Water 2695高效液相色谱仪（Waters 996二级管阵列检测器，色谱工作站MasslynxV4.0），高效制备液相色谱仪（Waters2525泵，带2767自动收集系统，2996二级管阵列检测器，色谱工作站MasslynxV4.0）；高效液相色谱-质谱联用仪：Waters 2695高效液相色谱系统，美国Micromass Quattro micro？誖质谱仪（电喷雾离子源（ESI）），Masslynx V4.1液质联用分析软件。

1.1.3 主要试剂 甲醇（色谱纯，德国CNW），乙腈（色谱纯，德国CNW），去离子水（Millipore）。液质联用分析所用的高纯氮气购自武汉和远汉盛气体有限公司，纯度为99.999%。

1.1.4 菌株来源 真菌菌种SF-21483由湖北省农业科学院生物农药工程研究中心分离、保存。黄色镰刀菌（Fusarium culmorum）、立枯丝核菌（Rhizoctonia solani）、葡萄灰霉（Botrytis cinema）、小麦颖枯病菌（Septoria nodorum）、番茄早疫菌（Alternaria solani），由湖北省农业科学院生物农药工程研究中心提供。

1.2 色谱条件

1.2.1 分析条件 色谱柱：美国Sunfire？誖 C18 柱，150 mm×2.1 mm（i.d），粒径3.5 μm。柱温40 ℃。流动相：A.去离子水；B.乙腈（梯度洗脱）。进样量3 μL。流速0.3 mL/min。检测条件：PDA全波长扫描。

1.2.2 制备条件 色谱柱：美国Sunfire？誖 OBD C18 Prep柱，250 mm×19 mm（i.d），粒径10 μm。柱温室温。流动相：A.去离子水；B.乙腈（梯度洗脱）。进样量3 000 μL。流速27 mL/min。检测条件：PDA全波长扫描。

1.2.3 质谱检测条件 MS条件：电喷雾电离（ESI），毛细管电压为3.5 kV，锥孔电压为45 V，离子源温度为100 ℃，脱溶剂温度为300 ℃，脱溶剂气体流速500 L/h，锥孔气体流速为50 L/h。

1.3 方法

1.3.1 种子培养 用无菌接种环从斜面中取少量孢子或菌丝转入种子培养基中，在旋转式摇床上28 ℃、130～140 r/min培养96 h。每次每菌株准备10瓶。移种前，对每瓶种子进行取样镜检，以排除有污染的摇瓶。

1.3.2 摇瓶发酵 待种子培养好时，转入500 mL锥形瓶中装样100 mL，接种后的锥形瓶置于旋转式摇床上28 ℃、130～140 r/min培养7 d。

1.3.3 活性物质的提取 将真菌SF-21483发酵液离心，分别将菌丝体和上清用乙酸乙酯进行提取2次，合并提取液，真空减压浓缩至干，加入适量甲醇，离心，备用。

1.3.4 活性成分分布 取少量备用液进行半制备，所用色谱柱为美国Sunfire？誖C18反相柱（10 μm，250 mm×10 mm）， 进样体积800 μL，柱温为室温，流速为7.5 mL/min，流动相为乙腈和去离子水，采用梯度洗脱，乙腈的浓度在25 min内由5%变至100%。每分钟收集一个组分，用干净空气吹干后进行生物活性测定，确定活性成分分布位置。

1.3.5 纯品的制备 根据1.3.4活性分布结果，确定活性部位的保留时间。先采用分析液相摸索出适合活性化合物分离的流动相梯度。然后将此梯度直接放大到制备液相中，分离纯化出活性物质单组分，制备时所用色谱柱为美国Sunfire？誖prep-C18反相柱（5 μm，19 mm×250 mm）， 进样体积2 000 μL，柱温为室温，流速为27 mL/min。

1.3.6 组分纯度及分子量的测定 将1.3.5分离纯化的单组分化合物干燥，溶于色谱级甲醇中，取1 mL于LC-MS检测，确定化合物的纯度及分子离子峰，根据紫外吸收光谱、分子离子峰及碎片离子判断化合物的归属。

2 结果与分析

2.1 真菌SF-21483发酵提取物中活性组分的测定

半制备活性跟踪试验显示，主要活性组分出现在20～26 min内。结果表明，此段组分具有较强的抗真菌活性，其余保留时间均无活性（图1）。通过图1可知，20～26 min的组分主要有peak19.90、peak23.42、peak24.77和peak25.82。

2.2 真菌SF-21483活性化合物的分离纯化

根据2.1活性分布结果，明确活性部位的保留时间分布在20～26 min。由此，先采用分析液相考察在1.2.1色谱条件梯度下保留此时间段的分离度。检测结果表明，20～26 min时段内组分较为集中，分离度较小。虽然半制备结果表明主要含有5个活性组分，但是LC-MS检测结果表明20～26 min时段内含有较多的化合物（图2），这可能和分析柱的柱效较高有关。本试验半制备的色谱柱粒径10 μm，而分析液相色谱柱的粒径为3.5 μm，柱效（理论塔板数）远高于半制备色谱柱[3]。因而在分析条件下，更能清晰的检测出相同时间段所有组分。这些化合物的紫外最大吸收值较为接近，均在230、290、345 nm左右，由此判断，可能是同系物或者类似物。因为这些化合物均集中在20～26 min时段内，此段化合物属于中等偏弱极性化合物。对此较为集中且组分较多的样品分离纯化，先采用梯度1条件，每个峰均收集。然后根据梯度1的保留时间段流动相配比，设计出梯度2[4]，将这些收集到的组分再进一步分离纯化，得到了5个纯度较高的化合物，这些化合物的理化性质见表2。

2.3 真菌SF-21483发酵提取物中的各活性组分LC-MS归属

将得到的5个化合物分别称量1 mg溶于1 mL甲醇中，于LC-MS上进样5 μL，测定各个组分的分子离子峰（表3）。由表3可知，这5个活性组分的分子离子峰分别为4（462.2）、5（402.2）、7（404.2）、9（406.2）、10（433.3）。紫外吸收光谱也较为接近，最大吸收值分别在230、290、345左右。对比这些化合物紫外吸收光谱、相对分子质量、物理性状、来源及生物活性，经过查询天然产物化合物词典（DNP）和文献，初步推断4、5、7、9、10这5个组分与冬青生菌素较为接近[5-7]。冬青生菌素是由真菌Cylinddrocladium ilicicola MFC-870产生的抗生素[8，9]，含有A、B、C、D、E、F、G和H等8个组分。相对分子质量分别为A 390、B 356、C 406、 D 404、E 402、F 462、G 404、H 433，最大紫外吸收值分别为A ：230、296、344，B： 233、 296、 340，C： 230、295、347， D： 240、250、292、346，E： 240、 290、346，F： 240、294、348，G：230、295、349， H： 248、349。而4、5、7、9、10这5个活性组分是由真菌菌株SF-21483产生，分子离子峰分别为4（462.2）、5（402.2）、7（404.2）、9（406.2）、10（433.3）。紫外吸收值也较为接近：4（242、292、337）、5（236、291、337）、7（237、298、338）、9（230、292、348）、10（245、347）。物理性状分别为4（淡黄色结晶）、5（淡黄色结晶）、7（淡黄色结晶）、9（黄色针状结晶）、10（黄色针状结晶）。结果表明，5个组分均具有一定的抗真菌活性。由此判断，活性组分4为冬青生菌素F（Ilicicolin F）、活性组分5为冬青生菌素E（Ilicicolin E）、活性组分7为冬青生菌素D（Ilicicolin D）、活性组分9为冬青生菌素C（Ilicicolin C）、活性组分10为冬青生菌素H（Ilicicolin H）。

2.4 SF-21483发酵提取物中各活性组分的抑菌活性

将SF-21483发酵提取物分离纯化得到的这5个活性组分分别在5个真菌病原菌靶标下的1.0、0.3、0.1 mg/mL浓度下进行生物活性测试，结果表明，这些活性组分均具有一定的抑制植物病原真菌的作用（表4）。由表4可知，活性组分4仅在1.0 mg/mL浓度下有活性；活性组分4在3个浓度下均对小麦颖枯、立枯丝核菌均有较强的抑制作用；活性组分5的活性最强，在3个浓度下对其中的3个靶标均具有较强的活性；活性组分9对小麦颖枯、番茄早疫在3个浓度下有较强的活性；活性组分10对葡萄灰霉、番茄早疫、立枯丝核具有一定的抑制作用。

3 小结与讨论

本试验从SF-21483的发酵提取物中分离得到的组分4、5、7、9、10与化合物冬青生菌素（Ilicicolins）相似，具有较强抗真菌作用。文献研究多集中在Ilicicolin H，它是2-吡啶酮类化合物。体外抗菌活性研究表明，该化合物抑制炭疽杆菌（Bacillus anthracis）的剂量为6 mg/mL[8]。其作用机制在最近才被阐明，在酵母中作用于线粒体， 抑制呼吸链中泛醌位点[10]。目前该类化合物的研究主要集中在抗菌机理上，在农药应用方面的研究很少报道。本试验主要是从真菌SF-21483的次生代谢产物应用于植物病原菌的防治上进行了研究，为真菌SF-21483在农业上的应用做了初步的探讨。

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