液相色谱串联质谱法在检测鸡肉和鸡蛋中氯霉素残留的应用

管祖东　吕小玲　李文迹　罗忠宝

（福建圣农发展股份有限公司　福建光泽　354100）

液相色谱串联质谱法在检测鸡肉和鸡蛋中氯霉素残留的应用

管祖东吕小玲李文迹罗忠宝

（福建圣农发展股份有限公司福建光泽354100）

建立了鸡肉、鸡肝和鸡蛋中氯霉素的高效液相色谱串联质谱测定方法，试样经三氯乙酸除蛋白及乙酸乙酯液液萃取提取和净化后，C18柱HPLC进行分离，多反应选择离子检测。方法的回收率和变异系数分别在80%～110%和8%～10%。该方法对鸡肉中氯霉素检测限为0.1μg/kg。

液相色谱串联质谱氯霉素残留鸡肉鸡蛋

氯霉素是第一个可人工合成的抗生素，主要用于肠道感染，同时亦可用于子宫炎、乳腺炎等局部感染。但由于其在动物体内产生残留，主要会抑制骨髓造血机能，对人体危害较大［1］，欧盟很早就禁止其应用于可食性动物的饲养过程［2］，我国也出台相应的政策、法规及测定标准，禁止其用于食用动物［3］。国内外关于氯霉素的残留分析方法有高效液相色谱法（HPLC）、气相色谱质谱法（GC-MS）［4］、高效液相色谱-质谱联用法（HPLC-MS）［5-6］。其中HPLC检测灵敏度低；GC-MS需进行衍生化样品，前处理繁琐；HPLC-MS在氯霉素残留检测中发挥着重要作用，但肝脏及鸡蛋中残留检测分析有待完善。本研究建立了鸡肉、鸡肝和鸡蛋中氯霉素的检测方法，该方法准确、灵敏度高，适合鸡肉、鸡肝和鸡蛋中氯霉素的快速确证分析。

1　材料与方法

1.1药品与试剂氯霉素，含量99.0%，德国Dr. Ehrenstorfera公司；乙酸铵、甲酸、乙腈、甲醇、乙酸乙酯均为色谱纯。

1.2仪器与设备Agilent 6460液相色谱串联质谱；吹氮浓缩装置，北京八方；IKA MS 3 basic微型混合器；水浴恒温振荡器等实验室常用设备。

1.3样品前处理

1.3.1氯霉素提取

1.3.1.1鸡肉和鸡肝的前处理称取经肉类组织粉碎的试样5 g（精确至0.01 g）于50 mL离心管中，加入氯霉素-D5工作液（50 ng/mL）100μL，再加入乙酸乙酯约15 mL，震荡提取0.5 min，以4 000 r/min离心5min。上清液经过一装有约10 g无水硫酸钠的漏斗，收集乙酸乙酯提取液于250 mL棕色鸡心瓶中。残渣用10mL乙酸乙酯重复提取1次，合并2次提取液乙酸乙酯。

1.3.1.2鸡蛋的前处理称取经肉类组织粉碎的鸡蛋样5 g（精确至0.01 g）于50 mL离心管中，加入氯霉素-D5工作液（50 ng/mL）100μL，再加3 g/L三氯乙酸2 mL，加入乙酸乙酯约15 mL，震荡提取0.5min，以4 000 r/min离心5min。上清液经过一装有约10 g无水硫酸钠的漏斗，收集乙酸乙酯提取液于250mL棕色鸡心瓶中。残渣用10mL乙酸乙酯重复提取1次，合并2次提取液乙酸乙酯。

1.3.2净化方法将鸡心瓶中乙酸乙酯置于旋转蒸发仪上，在40℃水浴中减压蒸发至干。加入2 mL5%乙腈-水溶液溶解残留物，将溶解液移入15 mL离心管中，加入5 mL正己烷，漩涡震荡0.5min，以4 000 r/min离心5min。弃去正己烷层，重复1次。5%乙腈-水层过艾杰尔PEP萃取柱。（1）加入5 mL甲醇活化，然后用5 mL水平衡；（2）上样；（3）用5mL 5%甲醇淋洗；（4）5mL乙腈洗脱。将洗脱液置于氮气流下吹至近干，用5%乙腈-水定容至1mL，过0.22μm微孔滤膜，置2mL样品瓶。

1.4测定

1.4.1色谱条件a）色谱柱：Agilent Eclipse Plus C18，3.5μm×100 mm×2.1 mm（id）；b）流动相：乙腈+0.005mol/L乙酸铵水溶液，梯度洗脱模式。梯度表分别见表1。c）柱温：25℃；d）进样量：10μL。e）接口及离子化方式：ESI+AJS，正离子检测。干燥气6 L/min，干燥温度350℃，鞘气10 L/min，鞘气温度250℃，气体均为氮气；电离电压：3 500 V，各离子对的去簇电压、碰撞能CE见表2。

表1　流动相梯度表

1.4.2质谱条件见表2。

2　结果与讨论

2.1质谱条件的优化将1μg/mL标准溶液用蠕动泵以5μL/min的流速连续注射入质谱仪，在负离子模式下先进行一级质谱分析（Q1扫描），得到准分子离子峰（M-1）即m/z321，优化去簇电压。对m/z 321进行二级质谱分析，得到碎片离子信息，优化碰撞电压，然后对离子源温度、干燥气、辅助鞘气等进行优化。再以多反应监测（MRM）负离子模式优化去簇电压等质谱参数。分别选择丰度较强的2个子离子为定量及定性离子，以母离子与子离子组成监测离子对，进行定性和定量分析。

表2　质谱参数

2.2样品前处理条件的选择液液萃取是一种比较经典的净化方法，它是利用待测组分与样品杂质在两相中的溶解性差异来净化样品的。样品提取过程中不可避免的会携带许多与待测组分溶解性相似的杂质一并转移出来，这些微量的杂质会干扰光谱检测、增加基线噪声、降低柱效、堵塞色谱管路、污染色谱柱和检测器。根据药物的理化性质，通过液液萃取将待测组分与杂质进行分离，通过这样的一些过程使样品达到净化的效果，便于检测。本研究鸡肉中氯霉素的残留用乙酸乙酯作为提取剂，鸡蛋中含蛋白质和脂肪较高，对检测的干扰大，先加入三氯乙酸沉淀蛋白，减少提取过程中的干扰，本研究比较了乙酸乙酯和乙腈的提取。结果表明，乙酸乙酯萃取基质干扰少、回收率高、前处理相对简单。

2.3方法的定量限、回收率、重复性及线性范围在以上确定的测定条件下，配制标准系列（n=6），分析化合物的浓度比为X轴，以分析物的峰面积比为Y轴作标准曲线。结果表明，氯霉素浓度在0.1～20 μg/L时，线性关系良好，其相关系数和回归方程为Y=1.298125*X-0.004766，r2=0.9995。在空白样品中添加氯霉素和氯霉素内标标准溶液，进行3个水平浓度的添加回收试验，每个浓度6个重复。见表3。

表3　样品添加回收率及精密度测试结果（n=6）

图1　空白鸡肉样品离子图谱

图2　添加0.1μg/kg氯霉素样品离子色谱图

3　结　论

鸡肉中的氯霉素残留可利用高效液相色谱串联质谱法进行快速测定，该方法非常适合鸡肉中氯霉素的快速定量定性分析，在0.1～20μg/kg添加水平范围内的平均回收率为88.4%～106.2%，相对偏差为9.0%～10.1%，方法检测限等指标满足国内外检测的相关要求。

［1］Comm ission Regulation（EC）No.2788/98.O ff J Eur Commun，1998-12-23（L347/31）.

［2］Food and Agriculture O rganization of the United Nations（FAO）and W orld Health O rganization（WHO）.Joint FAO/ WHOExpert Committee on Food Additives Sixtieth Meeting，Geneva：FAO/WHO，2003.

［3］农业部.中华人民共和国农业部公告第235号［EB/OL］. （2002-12-24）.http：//yz.hz-agri.gov.cn/uploadFiles/2005-10/1130221564406.doc

［4］中华人民共和国国家质量监督检验检疫总局，中国国家标准化管理委员会.GB/T 22338-2008动物源性食品中氯霉素类药物残留量的测定［S］.北京：中国标准出版社，2008.

［5］中华人民共和国国家质量监督检验检疫总局，中国国家标准化管理委员会.GB/T 20756-2006可食动物肌肉、肝脏和水产品中氯霉素、甲砜霉素和氟苯尼考残留量的测定：液相色谱-串联质谱法［S］.北京：中国标准出版社，2006.

［6］中华人民共和国国家质量监督检验检疫总局.SN/T 1864-2007进出口动物源性食品中氯霉素残留量的检测方法：液相色谱-串联质谱法［S］.北京：中国标准出版社，2007.

Determ ination of the residues of chloram phenicols in chicken and eggs by high performance liquid chromatography-tandem mass spectrometry

Guan Zudong Lv Xiaoling LiWenji Luo Zhongbao
（Fujian sunner development CO.，LTD.，Guangze 354100）

A high performance liquid chromatography-tandem mass spectrometry（HPLC-MS/MS）method was developed for the quantitative determination of chloramphenicols respectively in the chicken and liver of chicken and eggs.The chloramphenicols in eggs were deproteinated with acetocaustin acid and acetic ether followed by liquid-liquid extraction.Further clean-up was performed by solid phase extraction（SPE）throughmixed mode columns（PEPSPE）.The separation of the compoundswas carried on a Agilent Eclipse Plus C18 column（C18，3.5μm×100 mm×2.1 mm（id）by a gradient elution using acetonitrile and 0.1%formic acid asmobile phases. The analyteswere detected by tandem mass spectrometry inmultiple reactionmonitoring（MRM）modewith negative electrospray ionization．The chloramphenicols quantified by internal standard method．The linear rangeswere 0.1～20.0μg/L and the correlation coefficientswere not less than 0.9995.The average recoveries and relative standard deviations ranged from80%-110%and 8%～10%respectively at the spiked levels of 0.1，0.2 and 1.0μg/kg for the bothmarkers.The limit of quantitation（LOQ）was 0.1μg/kg.Themethod is sensitive，accurate and suitable for the determination and confirmation of chloramphenicols in chicken and eggs.

HPLC-MS/MS chloramphenicols residue chicken eggs

A

1003-4331（2015）02-0028-03

福建省区域科技重大项目（2012N 3011）“规模化白羽肉鸡肉品生产兽药残留监控技术的研究与应用”资助。