丹参素、羟基红花黄色素A单用及合用对大鼠心肌缺血/再灌注损伤的保护作用△

胡天鑫，文爱东，朱艳荣，关月，赵润怀

(1.江西中医药大学，江西 南昌 330004；2.第四军医大学 西京医院，陕西 西安 710032；3.中国中药公司，北京 100195)

丹参素、羟基红花黄色素A单用及合用对大鼠心肌缺血/再灌注损伤的保护作用△

胡天鑫1，2，3，文爱东2，朱艳荣2，关月2，赵润怀3*

(1.江西中医药大学，江西 南昌 330004；2.第四军医大学 西京医院，陕西 西安 710032；3.中国中药公司，北京 100195)

目的：观察丹参素、羟基红花黄色素A单用及合用对大鼠心肌缺血/再灌注(myocardial ischemia-reperfusion，MI/R)损伤的保护作用。方法：采用冠状动脉左前降支结扎复制大鼠MI/R损伤模型，缺血30 min，再灌注180 min，再灌注即刻尾静脉给药。将36只SD大鼠随机分为6组，每组6只，分别为假手术组、模型组、丹参素组(2 mg·kg-1)、羟基红花黄色素A组(0.05 mg·kg-1)、丹红注射液阳性对照组(2 mL·kg-1)及丹参素、羟基红花黄色素A合用组[2.05 mg·kg-1，等同于丹红注射液(DHI)中相应的含量]，假手术组和模型组给予0.9%氯化钠溶液(2 mL·kg-1)。再灌注结束后，伊文思蓝(EB)、2，3，5-氯化三苯基四氮唑蓝(TTC)双染法测定心肌梗死面积；酶联免疫吸附试验(ELISA)试剂盒检测血清中肌酸激酶同工酶(CK-MB)、肌钙蛋白I(cTnI)水平；试剂盒比色法检测乳酸脱氢酶(LDH)活力；肢体导联ECG监测ST段变化。结果：造模后各组大鼠心梗面积、血清cTnI、LDH和CK-MB水平均有升高，与假手术组比较差异有统计学意义(P<0.05)；与模型组相比，各用药组均可改善MI/R损伤；丹参素、羟基红花黄色素A合用后大鼠心梗面积(P<0.05)、血清中CK-MB、cTnI、LDH的浓度显著下降(P<0.05)。结论：丹参素、羟基红花黄色素A对各项药效指标均具有改善作用，两者合用后在降低心梗面积、抑制cTnI、LDH和CK-MB水平方面作用加强，对MI/R损伤心肌起到增强保护的作用。

丹参素；羟基红花黄色素A；合并用药；心肌缺血再灌注损伤；酶联免疫吸附试验

冠心病是威胁人类健康的重大疾病，随着冠脉内溶栓和冠脉搭桥等治疗手段的广泛应用，心肌缺血/再灌注(MI/R)损伤导致心肌结构破坏加重，心肌坏死范围扩大，影响冠心病患者的预后[1]。

中药治疗MI/R损伤疗效确切、前景良好，其中以丹红注射液的治疗效果较好。丹红注射液由丹参及红花两味中药组成，其中丹参味苦，性微寒，为主药；红花味辛，性温，为辅药。红花中已经明确的药效成分主要包括羟基红花黄色素A和红花总黄色素；丹参中的药效成分主要包括丹参酮类、丹酚酸类以及丹参素等[2-4]。目前对于丹参素和羟基红花黄色素A药理作用的研究较多，分别在抗氧化、抗炎、抗凋亡等方面发挥心肌保护作用[5-11]，但丹参素与羟基红花黄色素A合用对大鼠MI/R损伤保护作用的研究尚未见报道。本研究拟应用大鼠MI/R损伤模型，以阳性药丹红注射液作为对照，观察丹参素与羟基红花黄素A联合应用对MI/R损伤的保护作用，为药物联合应用治疗MI/R损伤提供新的思路和参考。

1 材料

1.1 仪器

HX-100E小动物呼吸机(成都泰盟科技有限公司)；TDZ4A-WS低速台式离心机(湖南湘仪实验室仪器开发有限公司)；680型酶标仪(Thermo Fisher，USA)；COOLPIX S1型照相机(Nikon公司)；BL-420S系列生物机能实验系统(成都泰盟科技有限公司)。

1.2 试药

丹参素(西安鸿生生物有限公司，批号：110516)；羟基红花黄色素A(成都贝斯特试剂有限公司，批号：BRS011748)；肌酸激酶同工酶(CK-MB)ELISA检测试剂盒、肌钙蛋白I(cTnI)ELISA检测试剂盒(上海西唐生物科技有限公司)；乳酸脱氢酶(LDH)活性测定试剂盒(南京建成生物工程研究所)；戊巴比妥钠(Sigma，USA)；2，3，5-氯化三苯基四氮唑蓝(TTC)染色剂(中国医药集团上海化学试剂公司)；伊文思蓝(EB)(Sigma-Aldrich，USA)。

1.3 动物

清洁级雄性健康SD大鼠36只，体重220～260 g，动物许可证号：SCXK-(军)2007-007，由第四军医大学动物中心提供。动物分笼饲养(温度22～25 ℃，湿度50%～70%)，定时给予全价营养饲料喂食，术前12 h禁食，自由饮水。将大鼠随机分为6个组，分别为假手术组、模型组、丹参素组、羟基红花黄色素A组、合用组、丹红注射液对照组，每组6只。

2 方法

2.1 给药

假手术组：只穿刺不结扎，注射0.9%氯化钠溶液(2 mL·kg-1)；模型组：注射0.9%氯化钠溶液(2 mL·kg-1)；丹参素组：给予丹参素(2 mg·kg-1)；羟基红花黄色素A组：给予羟基红花黄色素A (0.05 mg·kg-1)；合用组：2.05 mg·kg-1(按照丹红注射液中该成分含量制备[12-13])；阳性药物对照组：丹红注射液，给药剂量为2 mL·kg-1。各组均于再灌注即刻给药，所有注射药液均用0.9%氯化钠溶液稀释，给药方式均为尾静脉给药。

2.2 动物模型制作

将大鼠称重，按2 mL·kg-1剂量腹腔注射3%戊巴比妥钠，仰卧位固定于专用木板上，连接生物机能实验系统，监测心电，切开气管，插入自制插管并用缝合线打结固定，连接小动物呼吸机(频率：75次·min-1；潮气量：8～9 mL；呼吸比为2∶1)，待大鼠心电图正常后于胸骨左缘旁纵行切开，第3～5肋间做横行切口开胸，撕开心包膜暴露心脏。以左心耳下缘、肺动脉圆锥左缘交界处的左冠状动脉前降支为标志，左心耳下方1～2 mm处进针，横跨左冠状动脉前降支穿线，将硅胶套管从丝线两端穿入，稳定10 min后结扎，结扎缺血30 min后剪开丝线，再灌注180 min结束。成功标准：结扎左冠状动脉前降支后心电图II导联ST段出现向上抬高，T波高耸等为缺血成功；放松结扎线后抬高的ST段下降1/2以上为再灌注成功[14]。假手术组动物只穿线不结扎。实验过程中大鼠处置方法符合动物伦理学标准要求。

2.3 心肌梗死面积测定

再灌注180 min后再次结扎各组大鼠左冠状动脉前降支，从下腔静脉迅速注入3%EB溶液2 mL，待大鼠口唇及四肢末梢皮肤蓝染后迅速摘除心脏，0.9%氯化钠溶液洗净染液，滤纸吸干后-80 ℃冻存。取出后在心脏结扎线以下，平行于房室沟均匀地将心脏横切成5片，选取相同位置即第三片进行染色，2%TTC溶液(pH=7.4)37 ℃孵育10 min，4%多聚甲醛固定过夜。染色后白色代表梗死区(AN)，红色代表缺血但未梗死区，蓝色代表正常区，红色和白色面积之和代表危险区(AAR)[15]。选定靠近结扎线一侧为正面，采用Image-Pro Plus 6.0图像分析软件进行分析，梗死程度采用AN/AAR值表示。

2.4 心电图采集

大鼠造模缺血30 min，剪断丝线再灌注180 min，采用生物机能实验系统下“心电”项，分别记录各组大鼠正常心电图，结扎后10、30 min心电图，剪断丝线再灌注10、60、180 min心电图，每组读取第一个ST段对应电压值(mV)。

2.5 血清生化指标测定

再灌注180 min后，腹主动脉取血，室温静置30 min，离心(4 000 r·min-1)10 min，分离血清，按照试剂盒说明书方法检测CK-MB、cTnI的含量以及LDH的活性，计算占DHI组药效的百分比，公式为(模型组-给药组)/(模型组-丹红注射液组)×100%。

2.6 统计学方法

3 结果

3.1 丹参素、羟基红花黄色素A单用及合用对大鼠心肌梗死面积的影响

大鼠缺血30 min，再灌注180 min后，模型组大鼠心肌出现明显的梗死，AN/AAR为(47.4±4.36)%，与假手术组相比，模型组大鼠心肌梗死面积显著增加(P<0.01)，表明MI/R损伤模型制作成功。模型给予丹参素、羟基红花黄色素A、合用药及丹红注射液组的AN/AAR依次为(32.2±1.87)%、(32.8±2.04)%、(19.2±2.31)%、(15.4±1.29)%。丹参素与羟基红花黄色素A合用相比于单用组能显著降低MI/R损伤大鼠心肌梗死面积(P<0.05)，且合用相当于丹红注射液药效的(88.13±2.97)%。见图1。

注：与模型组比较，*P<0.05，**P<0.01；与假手术组比较，▲▲P<0.01；与合用组比较，△P<0.05图1 各组大鼠心肌梗死程度(n=6)

3.2 丹参素、羟基红花黄色素A及合用对MI/R大鼠血清CK-MB、LDH和cTnI的影响

与假手术组比较，模型组大鼠血清CK-MB、LDH和cTnI水平明显增加(P<0.05)。丹参素、羟基红花黄色素A及其合用组的大鼠血清CK-MB、LDH和cTnI水平显著下降，与模型组相比差异有统计学意义(P<0.05)。合用组大鼠血清CK-MB、LDH和cTnI水平下降程度，与单用组相比差异有统计学意义(P<0.05)，且合用组相对于阳性药丹红注射液组各药效的百分比均高于单独给药组相应的百分比。见表1。

表1 各组对大鼠血清CK-MB、LDH和cTnI的影响

注：与假手术组比较，*P<0.05；与模型组比较，△△P<0.01，△P<0.05；与合用组比较，#P<0.05。

3.3 各组大鼠心肌MI/R造模前后心电图ST段的变化

结扎冠状动脉后，各组大鼠心电图ST段皆有一定的升高。剪开丝线再灌注后，丹参素组、羟基红花黄色素A组、合用组及丹红注射液组不同时刻ST段升高幅度均有一定程度下降，与结扎前相比差异有统计学意义(P<0.05)。见图2、表2。

表2 各组对大鼠心肌MI/R损伤后心电图ST段的影响 mV

注：与结扎前比较，△P<0.05。

图2 大鼠心肌MI/R造模前后心电图ST段的变化

4 讨论

冠心病是对人类生命威胁最大的疾病之一。虽然早期及时再灌注心脏是防止心肌组织缺血，造成进一步损害的有效方法，但缺血组织恢复血流灌注时，往往导致再灌注区域心肌细胞及局部血管网产生显著的病理变化，而这些变化的共同作用可导致组织的进一步损伤，即MI/R损伤。本研究通过应用EB-TTC大鼠心肌标本双染色法、心肌酶药效指标证实了丹参素、羟基红花黄色素A合用对大鼠MI/R损伤具有增强保护的作用。

梗死面积被认为是衡量MI/R损伤的金标准[16]。由于心肌梗死是不可逆损伤，通常采用AN/AAR值来说明MI/R的损伤程度。实验造成MI/R损伤后，给予丹参素、羟基红花黄色素A及其合用均能够降低大鼠心梗面积(P<0.05)，并且数据统计显示两者合用能进一步降低心梗面积，可以达到使用丹红注射液效果的88.1%，说明两者在降低心梗面积作用中起到关键作用。心肌酶CK-MB、LDH和cTnI被认为是心肌细胞受损程度的重要标志酶[17]。缺血损伤心肌导致细胞膜通透性改变，细胞内CK-MB漏出增加。实验造成大鼠急性再灌注损伤后，血清CK-MB升高，与假手术组比较，差异有统计学意义(P<0.05)。LDH和cTnI也在造模后较假手术组有明显的升高(P<0.05)。丹参素、羟基红花黄色素A及合用均能够显著降低由心肌受损引起的各项指标的升高(P<0.05)。同样，两者合用相比于阳性药丹红注射液组，在心肌酶指标降低的程度中贡献大于单独使用组(P<0.05)，说明两者合用能够增强保护作用，并且基本能够代表丹红注射液药效的60%左右，在丹红注射液发挥心肌保护中处于重要地位。急性心肌梗死进展期血管再通后，缺血心肌再灌注所致的室颤是冠心病人猝死的常见原因。动物心肌短暂缺血后，恢复血流供应也可导致严重的心律失常。ST段移位的电生理学基础是正常组织和心肌缺血区之间出现的损伤电位差，电位差愈大，ST段抬高的程度愈大[4]。本实验中，假手术只穿线不结扎，未见心电显著异常，结扎后ST段明显上抬(P<0.05)，再灌注后由于已对心肌产生损伤，故与正常心电相比存在差异。

综上所述，本研究结果表明丹参素、羟基红花黄色素A联合给药可以显著减少大鼠心肌梗死面积，降低大鼠血清中CK-MB、LDH和cTnI的生成和释放，联合使用对再灌注损伤的改善具有增效作用。从一定程度上验证了丹参、红花两味中药的配伍制剂——丹红注射液的药效作用。但本实验对丹参素和羟基红花黄色素A合用产生增效保护作用的机制并未进行研究，仍需在以后的工作中进一步探讨。

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ProtectiveEffectofDanshensuandHydrosafflorYellowAforUsingAloneorinCombinationonMyocardialIschemic-ReperfusionInjuryinRats

HU Tianxin1，2，3，WENAidong2，ZHUYanrong2，GUANYue2，ZHAORunhuai3*

(1.JiangxiUniversityofTraditionalChineseMedicine，Nanchang330004，China；2.DepartmentofPharmacy，XijingHospital，TheFourthMilitaryMedicalUniversity，Xi’an710032，China；3.ChinaNationalTraditionalChineseMedicineCorporation，Beijing100195，China)

Objective：To investigate the protective effect of Danshensu and hydrosafflor yellow A for using alone or in combination on myocardial ischemic-reperfusion(MI/R)injury in rats.Methods：The MI/R injury model was produced by making a slipknot around left anterior descending coronary artery(LAD).After 30 min of ischemia，the slipknot was released and followed by 180 min of reperfusion.All drugs were administered via tail intravenously injection within 5min at the beginning of reperfusion.The SD rats were randomly divided into 6 groups(n=6，each group)：Sham group；Myocardial ischemic-reperfusion(MI/R)group；MI/R and Danshensu group(2 mg·kg-1)；MI/R and hydrosafflor yellow A group(0.05 mg·kg-1)；MI/R and Danhong injection(2 mL·kg-1)group；MI/R and combination groupof Danshensu，hydrosafflor yellow A(2.05 mg·kg-1，equalto the content of DHI).Sham group and MI/R group were administered saline(2 mL·kg-1)via tail intravenously injection.At the end of reperfusion，the infarct size was determined by 3% Evans Blue and 2% triphenyltetrazolium chloride staining；CK-MB，cTnI and LDH levels were measured using standard kits by enzyme-linked immunosorbent assay(ELISA)and visible spectrophotometry.ST change were monitoredby ECG with limb leads.Results：The infarct size，the level of CK-MB，LDH and cTnI in model group were remarkably higher than sham group(P<0.05).Compared with model group，every group of drug administered couldalleviate the MI/R injury，the combination group could significantly reduce the level of infarct size，CK-MB，LDH and cTnI(P<0.05).Conclusion：Danshensu and hydrosaffloryellow A both can alleviate the injury induced by myocardial ischemic-reperfusionin rats.The combination can enhance the protective effect on MI/Rinjury in rats.

Danshensu；hydrosafflow yellow A；drugcombination；myocardial ischemic-reperfusion injury；enzyme-linked immunosorbent assay

2014-06-23)

国家自然科学基金(81173514)

*

赵润怀，研究员，研究方向：中药资源与产品开发研究；Tel：(010)88468190，E-mail：zhaorunhuai@sina.com

10.13313/j.issn.1673-4890.2015.1.004