陕重楼甾体皂苷类单体豆甾醇-3-O-β-D-吡喃葡萄糖苷对

张宇晨，宋延平，王昌利，王伟

(1.陕西中医学院，陕西 咸阳 712046；2.陕西中医药研究院，陕西 西安 710003)

·基础研究·

陕重楼甾体皂苷类单体豆甾醇-3-O-β-D-吡喃葡萄糖苷对

SMMC-7721细胞增殖的影响△

张宇晨1，宋延平2*，王昌利1，王伟1

(1.陕西中医学院，陕西 咸阳 712046；2.陕西中医药研究院，陕西 西安 710003)

目的：探讨陕重楼甾体皂苷类单体A(BM-26)豆甾醇-3-O-β-D-吡喃葡萄糖苷对人肝癌SMMC-7721细胞增殖的影响。方法：将不同浓度单体A(BM-26)与人肝癌SMMC-7721细胞分别在24、48、72 h处理后，采用MTT法，测定吸光度A值，并计算细胞增殖抑制率，检测陕重楼甾体皂苷类单体A(BM-26)对肿瘤细胞增殖的影响。结果：不同质量浓度陕重楼甾体皂苷类单体A(BM-26)对人肝癌SMMC-7721细胞均有抑制作用：24 h处理时，质量浓度为8、40、200 μg·mL-1，1、5、25 mg·mL-1组与对照组相比较，吸光度A值有显著性降低(P<0.01或P<0.05)；48 h处理时，质量浓度为0.3、1.6、8、40、200 μg·mL-1，1 mg·mL-1组与对照组相比较，吸光度A值有显著性降低(P<0.01或P<0.05)；72 h处理时，质量浓度为8、40 μg·mL-1组与对照组相比较，吸光度A值有显著性降低(P<0.01或P<0.05)。其中质量浓度为8 μg·mL-1时，在24、48、72 h抑制率分别为45%、41%、36%。结论：陕重楼单体A(BM-26)对人肝癌SMMC-7721细胞增殖具有一定的抑制作用，且最强抑制质量浓度为8 μg·mL-1，有效抑制质量浓度范围是8～40 μg·mL-1。

陕重楼甾体皂苷类单体A(BM-26)；人肝癌SMMC-7721细胞；细胞凋亡

重楼药用价值很高，具有清热解毒、消肿散瘀、止血止痛之功能[1]。常作为主药入方或单味用于肿瘤及其他病的治疗。陕产重楼，别名七叶一枝花、灯台七、蚤休，为百合科植物七叶一枝花ParispolyphyllaSmith Var.chinensis(Franch)Hara的干燥根茎，主产于秦岭、太白山等地区。能清热解毒、消肿止痛、凉肝定惊。用于治疗疔疮痈肿，咽喉肿痛，毒蛇咬伤，跌扑伤痛，惊风抽搐。[2]前期研究已证明陕西重楼乙酸乙酯提取部位和乙醇提取部位对离体H180和H22肿瘤细胞株有一定的抑制作用，本文中陕重楼正丁醇提取物单体化合物A(BM-26)为豆甾醇-3-O-β-D-吡喃葡萄糖苷(stigmasterol-3-O-β-D-glucopyranoside)，外观为无定型白色粉末，易溶于吡啶，可溶于甲醇，ESI-MS m/z：575 [M+H]+，分子式为C35H58O6。Liebermann-Burchard反应和Molish反应均呈阳性，说明陕重楼正丁醇提取物单体化合物A(BM-26)为甾体类成分。本文观察了陕重楼甾体皂苷类单体A(BM-26)豆甾醇-3-O-β-D-吡喃葡萄糖苷对人肝癌SMMC-7721细胞的影响。

1 材料

1.1 药物与试剂

陕重楼提取物单体A(BM-26)，由陕西中医学院药学院王昌利教授提供；顺铂注射液(齐鲁制药有限公司)；噻唑蓝(MTT)、二甲基亚砜(Sigma公司)；1640培养基(Gibco公司)；胎牛血清(Heclone公司)；胰蛋白酶消化液(西安舟鼎国公司)。

1.2 细胞

人肝癌SMMC-772l瘤株由中国医学科学院药物研究所引进，人民解放军第四军医大学实验动物中心提供。采用含有10%胎牛血清RPMI1640培养液，将人肝癌SMMC-7721细胞用贴壁细胞培养方式培养，置于37 ℃、5% CO2条件下，0.25%胰酶消化细胞，按1∶2 比例，2～3 d传代一次，取对数生长期细胞用于实验。

1.3 仪器

显微镜、普通光学显微镜(日本olympus公司)；TDZ4AWS台式低速自动平衡离心机；恒温培养箱(Heraeus公司)；96孔培养板(美国Corning公司)；酶标仪(美国BIO-RAD公司)。

2 方法

2.1 MTT法检测肿瘤细胞的生长

将SMMC-7721细胞按1×106/孔的密度接种于96孔培养板，每孔100 μL，培养24 h。实验分为12组，分别为对照组、阳性组、给药10个浓度梯度组。给药组加入不同质量浓度的BM-26药物，使其最终质量浓度分别为25、5、1 mg·mL-1，200、40、8、1.6、0.3、0.064、0.013 μg·mL-1；空白对照组加入与药物等体积的PBS缓冲液；阳性组(顺铂)药物最终质量浓度为30 μg·mL-1。每组设8个复孔，实验重复3次，分别培养24、48、72 h，弃上清液；加入质量浓度为5 mg·mL-1的MTT(10 μL/孔)，继续培养4 h，弃上清液；加入DMSO(100 μL/孔)，振荡10 min，用酶联免疫检测仪在570 nm处测吸收度，记录吸光度值，计算细胞增殖抑制率IR，计算公式：IR=(1-实验组A值/对照组A值)×100%。以抑制率(%)为纵坐标，药物浓度为横坐标绘制剂量—效应生长曲线，见图1。

2.2 统计学处理

3 结果

3.1 对人肝癌SMMC-7721细胞增殖的影响

24 h处理时，质量浓度为8、40、200 μg·mL-1，1、5、25 mg·mL-1组及阳性组与对照组相比较，吸光度A值有显著性降低(P<0.01或P<0.05)；48 h处理时，质量浓度为0.3、1.6、8、40、200 μg·mL-1，1 mg·mL-1组及阳性组与对照组相比较，吸光度A值有显著性降低(P<0.01或P<0.05)；72 h处理时，质量浓度为8、40 μg·mL-1组及阳性组与对照组相比较，吸光度A值有显著性降低(P<0.01或P<0.05)。其中质量浓度为8 μg·mL-1时，在24、48、72 h吸光度最小，抑制率分别为45%、41%、36%。结果见表1、图1。

表1 陕重楼甾体皂苷类单体A(BM-26)对人肝癌SMMC-7721细胞增殖的影响

注：与模型对照组比较**P<0.01，*P<0.05。

图1 陕重楼甾体皂苷类单体A(BM-26)对人肝癌SMMC-7721细胞抑制率的影响

4 讨论

中药抗肿瘤作用的研究已证实重楼醇提物有抗肿瘤、诱导凋亡等作用[3]。以此为参考，研究开发新的抗肿瘤药物对肝癌的治疗具有重要临床意义。

重楼化学成分为甾体皂苷、游离氨基酸、植物甾醇、植物蜕皮激素、黄酮和少量的微量元素。其中甾体皂苷为其抗肿瘤有效成分，甾体骨架的不同使其抗肿瘤活性表现出明显差异。甾体皂苷约占重楼总化合物的80%，其皂苷元多为薯蓣皂苷元，次为偏诺皂苷元，并含有氨基酸、甾酮、蜕皮激素、黄酮苷等化合物，其中重楼皂苷为抗肿瘤有效成分[4]。

有研究者对滇重楼的乙酸乙酯和正丁醇萃取物进行了系统研究，从中分离多个化学单体，并考察了分离鉴定的单体化合物的抗肿瘤作用[5]。

近年来对滇重楼的抗肿瘤研究已经从其药效作用深入到细胞毒性的作用，而对陕西重楼抗肿瘤药理研究却极少。李秦康[6]报导：陕西重楼乙酸乙酯提取部位和乙醇提取部位对S180、H22有一定的抑制作用，石油醚提取部位仅对H22有一定的抑制作用。笔者前期研究表明，陕重楼乙酸乙酯提取物可使肝癌SMMC-7721细胞系中Bcl-2蛋白表达水平降低，Bax蛋白的表达上调，Bcl-2/Bax值降低，从而诱导肿瘤细胞的凋亡[7]。

陕重楼单体A(BM-26)为豆甾醇-3-O-β-D-吡喃葡萄糖苷属甾体类皂苷。研究表明单体A质量浓度为8 μg·mL-1时，对人体肝癌SMMC-7721细胞的抑制作用最强，当剂量增加或降低时，抑瘤效果均降低，有效抑制浓度范围是8～40 μg·mL-1。其作用原理有待进一步研究。

[1] 肖培根，杨世林.新编中药志[M].北京：化学工业出版社，2002.704-711.

[2] 李世全，周大卫，杨光明.秦岭巴山天然药物志[M].陕西：陕西科学技术出版社，1987.245-246.

[3] 季申，周坛树，张锦哲.中药重楼和云南白药中抗肿瘤细胞毒活性物质Gracillin的测定[J].中成药，2001，23(2)：212-215.

[4] 王艳霞，李惠芬.重楼抗肿瘤作用研究[J].中草药，2005，36(4)：628-6.

[5] 王羽，张彦军，高文远，等.滇重楼的抗肿瘤活性成分的研究[J].中国中药杂志，2007，32(14)：1425-1428.

[6] 李秦康，王昌利.陕西重楼抗肿瘤活性成分研究[J].陕西中医学院学报，2011，34(3)：46-47.

[7] 宋延平，杨洁，王伟，等.陕重楼提取物对人肝癌SMMC-7721细胞bcl-2和Bax基因表达的影响[J].陕西中医，2013，34(4)：502-503.

Inhibiting effect of Rhizoma Parid Steroidal Saponins Monomer stigmasterol-3-O-β-D-glucopyranosideonProliferationofHumanhepatocarcinomaSMMC-7721Cells

ZHANG Yuchen1，SONG Yanping2*，WANG Changli1，WANG Wei1

(1.Shaanxi University of Chinese Medicine，Shaanxi xianyang 712046，China；2.Shaanxi Institute of Traditional Chinese Medicine，shaanxi Xi’an 710003，China)

Objective：To study the inhibitory effect of the Rhizoma Parid steroidal saponins monomer A(BM-26)stigmasterol-3-O-β-D-glucopyranoside on the proliferation of human hepatocarcinoma SMMC-7721 cells.Methods：The SMMC-7721 cells were treated with monomer A(BM-26)of different concentration in 24，48 and 72 hours respectively.MTT assay was applied to measure the inhibition ratio of proliferation，and the effect of A(BM-26)on proliferation of cancer cells was calculated.Results：A(BM-26)in different weight and concentration showed the inhibitory effect on SMMC-7721 cells.In 24 hours the absorbance A value of A(BM-26)in concentration of 8，40，200 μg·mL-1，1，5，25 mg·mL-1was remarkably lower than that of the control group，in 48 hours the absorbance A value of A(BM-26)in 0.3，1.6，8，40，200 μg·mL-1，1 mg·mL-1was remarkably lower than that of the control group，and in 72 hours the absorbance A value of A(BM-26)in 8，40 μg·mL-1was remarkably lower than that of the control group.The inhibiting effect was the highest with the concentration of 8 μg·mL-1.In 24 h，48 h，72 h inhibition rates were 45、41、36%，respectively.Conclusion：A(BM-26)has an certain inhibitory effect on SMMC-7721 cells，and the strongest inhibitory concentration is 8 μg·mL-1，and the effective inhibitory concentration ranges 8-40 μg·mL-1.

Rhizoma Parid steroidal saponins monomer A(BM-26)；hunman liver cancer SMMC-7721 cells；apoptosis

10.13313/j.issn.1673-4890.2015.2.008

2014-07-09)

陕西省中医管理局中医药科研课题(NO.JC17)

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宋延平，研究员，研究方向：肿瘤与心血管；E-mial：sypdd2003@163.com