红细胞溶血试验检测化妆品眼刺激性的初步研究

刘肃　何华红?戚莉莉

[摘要] 目的 探讨红细胞溶血试验在化妆品眼刺激性检测中的适用性。 方法 选用9种化妆品产品进行眼刺激试验，确定家兔红细胞50%发生溶血时的化妆品浓度（HD50值）和血红蛋白变性指数（DI，%），计算刺激指数IP= HD50/DI，以IP=HD50/DI值作为评价标准，进行眼刺激性分级。将红细胞溶血试验刺激性分级结果与家兔眼刺激试验（Draize eye test）结果进行分级一致性比较，初步分析体外试验的适用性。 结果 红细胞溶血试验与动物实验结果比较中，9种样品中有7种结果一致，一致率为77.8%（相关性为0.4962）。 结论 虽然实验结果说明两者有一定的相关性，但多方面而言，红细胞溶血试验能否真正取代动物实验还有待商榷。

[关键词]化妆品；眼刺激性试验；替代方法；红细胞溶血试验

[中图分类号] R115 [文献标识码] B [文章编号] 2095-0616（2015）16-188-04

Preliminary study on Red blood cell hemolysis test of draize alternatives

LIU Su HE Huahong QI Lili

Guangzhou Institute for Drugs，Guangzhou 510160， China

[Abstract] Objective To study the red blood cell hemolysis test on the applicability of the cosmetic eye irritation test. Methods 9 kinds of cosmetic products are chosen as the subjects， and determine the subjects of rabbit red blood cell hemolysis occurs in 50% subjects （HD50） and the initial concentration of hemoglobin denaturation index （DI， %）， the calculation of IP=HD50/DI， with IP=HD50/DI value as evaluation standard， make eye irritant grading. Results excitant grading erythrocyte hemolysis test and animal experiment results are compared， and grading consistency preliminary analysis the applicability of the in vitro. Results： Red blood cell hemolysis test and animal experiment result comparison， seven of nine subjects content is consistent， consistent rate was 77.8%（probability=0.4962）.Conclusion Though the experiment results show that both have certain relevance， but many ways， red blood cell hemolysis test failed to truly replace animal testing.

[Key words] Cosmetics； Eye irritation trial； Alternative methods； Red blood cell hemolysis test

眼刺激性是指动物的眼睛表面（包括角膜，巩膜及结膜部分）接触到化学物质从而产生炎症反应的过程，这个过程有可逆的，也有不可逆的。化妆品眼刺激性安全评价方法目前多用家兔试验即兔的眼刺激性试验（Draize eye test），该实验方法于1944年建立，目前仍是测定急性眼毒性的国际标准，但由于该试验依靠实验人员肉眼观察评分给出结果，存在一定的主观性；同时实验室与实验室之间的变异性也使该试验存在一定误差。而且近年来从动物保护和动物福利的角度出发，国际上多种替代动物实验的体外实验已经建立并被验证成为检测标准[1-4]。

红细胞溶血试验已经被纳入到欧洲委员会/英国内务府开展的替代家兔眼刺激试验之一，日本（Japanese ministry of health and welfare，MHW）/JCIA也已经在6～9个实验室进行了类似试验，结果显示[1]，红细胞溶血试验的实验室间的重复性较好。尽管它与兔眼刺激性试验中的MAS值的相关性不够强（-0.631），但仍可比较确定的从样品中分辨出强刺激物。

我国已建立了红细胞溶血试验方法， 并得出红细胞溶血试验的结果与兔眼刺激性试验具有较好相关性这一结论。张文改等[4-6]认为该实验方法适合评价洗发护发类化妆品的眼刺激性，能正确区分眼刺激性级别为轻刺激性及其以下刺激级别的化妆品；廖艳等[7]的研究结果也表明红细胞溶血试验可用于替代兔眼刺激性试验。

本研究拟在我所建立兔红细胞溶血试验模型，将其应用于化妆品原料和产品眼刺激性的检测与评价，以考察它替代动物眼刺激性试验用于化妆品安全性评价的可能性及应用前景。

1 材料与方法

1.1 样品及试验动物

全部样品均来源于广州市药品检验所药理室2014年1～9月送检的部分化妆品产品，共9个批次样品，其中面膜类2个，洗发类1个，去角质类2个，洁面类4个。全部样品均于密闭、室温（22℃）下保存。endprint

试验用家兔来自广州市药品检验所动物房，经检疫后选用健康成年白色家兔，性别不限，雌性不孕。

1.2 主要仪器及试剂

主要仪器：日立U-3900紫外分光光度计，低温高速28RS离心机（Biofuge），电子天平AB204-S，六孔水浴TW12。

主要试剂：十二烷基硫酸钠（SDS），广州学友生物科技有限公司；二甲亚砜（DMSO），美国AR公司；草酸钾，广州化学试剂厂。

1.3 实验方法

1.3.1 红细胞溶血试验 红细胞悬液的制备：健康家兔心脏取血7mL，加2%草酸钾溶液1mL，制备成新鲜抗凝兔血，加PBS 10mL稀释，4℃冰箱保存备用。

样品悬液的制备：根据预实验，选择合适的终浓度，配制样品系列溶液。每种样品均设立5个试验剂量。首选PBS为溶剂，对于不溶于PBS的样品选用DMSO为溶剂（终浓度≤0.5%）。必须保证各稀释样品悬液充分混匀。

溶血及蛋白变性测定：样品组每个浓度2支具塞试管，每管加入样品悬液10mL；阴性对照组2支具塞试管，每管加入PBS 10mL；阳性对照组2支具塞试管，每管加入蒸馏水 10mL。每支试管加入0.2mL稀释兔血，轻轻混匀，37℃孵育30min。结束后，离心10min，2000r/min，吸取上清液移入比色皿内，于分光光度计540nm，560nm及575nm测其吸光度（A）值。按公式①计算溶血率（%），公式②计算血红蛋白变性指数（DI，%）。

①

②

R1为空白对照蒸馏水的离心上清液A575/A540值；R2为样品离心上清液A575/A540值；R3为阳性对照SDS离心上清液A575/A540值[2]

主要观察指标：50%红细胞发生溶血时的样品浓度（HD50）、蛋白质变性指数（DI）、HD50与变性变性指数DI的比值（IP=HD50/DI）。

阳性对照：以十二烷基硫酸钠（SDS）为阳性对照，最终实验浓度为100mg/L。

1.3.2 家兔眼刺激试验（Draize eye test） 样品按不同剂量滴入每只试验动物一侧眼结膜囊内，另一侧为自身对照，在规定的时间间隔内，观察角膜、虹膜和结膜的反应并评分，以评价样品对眼睛的刺激作用[6]。

试验操作：轻轻拉开家兔一侧眼睛的下眼睑，将样品0.1mL或0.1g迅速滴入眼结膜囊中，令眼睑被动闭合2～3s，以防止样品丢失，另一侧眼睛不作任何处理以作自身对照。滴入样品后24h内不冲洗眼睛。若试验结果显示样品有刺激性，则另选用3只家兔进行冲洗效果试验，即给家兔眼滴入样品后30s，用生理盐水轻柔快速冲洗至少30s。在滴入样品后1、24、48、72h以及第4天和第7天对动物眼睛进行检查，观察结膜、角膜及虹膜的反应，并在24h时进行荧光素钠（1%，生理盐水配制）检查。如果在72h刺激反应消失，即终止试验。如有累及角膜或有其他眼刺激作用，7d内不恢复者，则继续观察至21 天。每次检查时均按《化妆品卫生规范》（2007）中眼损害的评分标准记录眼刺激反应的积分，最后按分级标准对受试样品进行眼刺激性分级[4，6]。

1.4 统计学处理

应用STATA统计软件分析数据。采用秩和检验法进行红细胞溶血试验刺激性分级结果和动物试验分级结果进行比较，判断两种试验结果分级的频数差别是否存在统计学意义。

2 结果

2.1 红细胞溶血试验结果

溶血率与样品浓度存在一定的线性关系，以样品浓度（mg/L）为横坐标，溶血率为纵坐标可求得HD50值（R2≥0.95）。进而，根据公式可求得DI及IP=HD50/DI。见表1。

2.2 眼刺激试验与红细胞溶血试验的分级结果比较

动物实验结果可以分为无刺激性（Ⅰ级）、微弱刺激性（Ⅱ级）、轻度刺激性（Ⅲ级）和严重刺激性（Ⅳ级）4个级别。

红细胞溶血试验的眼刺激分级为：L/D≥10、1≤L/D<10 、0.1 ≤L/D<1和L/D<0.1分别表示无刺激性（Ⅰ级）、微弱刺激性（Ⅱ级）、轻度刺激性（Ⅲ级）和严重刺激性（Ⅳ级）4个级别。

本次实验测得，9种化妆品样品中，有7种动物实验与红细胞溶血试验分级结果一致，1种不相符，还有一种无法获得结果。见表2。

根据STATA统计分析结果，probability= 0.4962，故按单向有序RC表资料进行秩和检验，结果显示这两种试验分类等级的频数的差别不显著，即在一定程度上红细胞溶血试验可取代动物实验。本实验结果红细胞溶血试验与动物实验结果相关性：9种物质中有7种分级结果一致。

3 讨论

红细胞溶血试验作为动物眼刺激试验的替代方法，问世已有20多年，科学家们研究了这两种方法的相关性、一致性和可靠性等，结论是基本确认红细胞溶血试验可以用于眼刺激性的评价，并有较好的准确性和可重复性。遗憾的是，公认的眼刺激性评价标准一直未有确定。红细胞溶血试验的基本原理是化学物质对红细胞膜的破坏从而产生胞质内蛋白的变性继而引起一系列的炎性反应[3，8-12]。不同化学物质损伤红细胞的具体机制可能存在差异，如表面活性剂可破坏膜的脂质结构，导致膜脆性增加和溶解，而某些酸、碱或有机溶剂可引起大分子蛋白质的沉淀/变性，而某些漂白剂和过氧化物对蛋白质的烷化和氧化攻击有可能并不表现为细胞膜溶解。通常大多数“无或弱的刺激物”不引起溶血和蛋白变性：“中度或严重刺激物”仅引起溶血而较少引起蛋白变性；“强或腐蚀性物质”易造成严重溶血及蛋白变性。当前较为合理的动物实验替代方案是首先通过物理化学特性预判物质的刺激性程度，而后采用多步体外实验“自下而上（首先进行非刺激性试验）”方式准确识别非刺激物，采用“自上而下（首先进行刺激性试验）”方式准确识别严重刺激物[13]。因此，本实验选择膜溶解（溶血）和血红蛋白变性两个检测终点，与仅用单一终点的替代方法相比，本实验能覆盖不同损伤机制，实验结果更具有代表性。endprint

也有研究表明，溶血实验中，选用小型猪红细胞和大鼠红细胞检测，前者更容易得出严重刺激性物质的分类结果，提示大型哺乳动物可能比啮齿类红细胞更接近人类而适宜进行溶血实验[14]，我们的实验选用家兔，更有代表性。

我们同时也看到了局限性：一方面，溶血试验过程中存在太多不稳定因素，而且实验中样品种类有限，未能代表性地反应所属种类的结果；另一方面，在实验过程中，样品的配制有一定干扰性：磨砂膏等难溶于溶剂或者是混合不均匀；样品中色素影响吸光度的测定，从而可影响结果的准确性。酸性物质本身会产生蛋白变性作用，所以对于酸性物质的评价也应谨慎[11]。另外有报道显示，溶血试验对于链烷醇胺和酒精类物质的检测阳性率较低，可出现假阴性结果。

[参考文献]

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[5] 张文改，杨杏芬.基于细胞的眼刺激性体外替代方法建立与化妆品限刺激性逐步检测策略的初步研究（硕士学位论文）[D].广州：中山大学，2007：15-18

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[11] 薛金玉，杨杏芬.基于细胞的眼刺激试验替代方法的研究进展[J].中国预防医学杂志，2009，7（10）：681-684.

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[13] 杨军，宋健.化妆品原材料与终产品的眼刺激动物实验替代策略[J].中国药理学与毒理学杂志，2013，11（27）：307.

[14] 敖华英，程树军，谈伟君.不同哺乳动物红细胞溶血替代眼刺激实验的比较[J].Chinese Journal of Tissue Engineering Research，2012，16（12）：2163-2166.

（收稿日期：2015-04-16）endprint