慢病毒介导的GATA6基因沉默对肝癌Huh-7细胞凋亡的影响*

才锦麟，阿力亚，何强(中山大学附属第一医院肝胆外科，广东广州510080)

慢病毒介导的GATA6基因沉默对肝癌Huh-7细胞凋亡的影响*

才锦麟，阿力亚，何强△
(中山大学附属第一医院肝胆外科，广东广州510080)

目的:研究GATA6基因沉默对肝癌Huh-7细胞凋亡的影响，同时探讨可能的作用机制。方法:构建靶向GATA6基因的慢病毒干扰载体，用流式细胞术确定转染效率，用RT-PCR和Western blotting法检测其对人类肝细胞癌细胞株Huh-7的干扰效果，流式细胞术检测细胞凋亡比例，Western blotting法检测各转染组Huh-7细胞NF-κB及Bcl-2蛋白表达。结果:靶向GATA6基因的慢病毒干扰载体感染肝癌Huh-7细胞后，转染效率为57.4%。GATA6在mRNA和蛋白水平的表达明显下降。GATA6沉默的肝癌Huh-7细胞凋亡比例增加(P＜0.05)，NF-κB和Bcl-2蛋白水平表达降低。结论:利用慢病毒载体干扰技术沉默GATA6基因的表达可以明显促进Huh-7细胞凋亡，其机制可能通过NF-κB信号通路调节凋亡相关蛋白的表达，进而影响细胞的凋亡。靶向GATA6的RNA干扰技术在肝癌的基因治疗中具有一定的研究价值。

GATA6基因;慢病毒;RNA干扰;肝细胞癌

［ABSTRACT］AIM:To explore the effectof GATA6 gene silencing on apoptosis of hepatocellular carcinoma Huh-7 cells.METHODS:RNA interference vectors of the targetgene GATA6 mediated by lentiviruswere constructed in vitro to transfect the hepatocellular carcinoma cell line Huh-7.The apoptotic rate of transfected cellswasmeasured by flow cytometry.The protein expression of GATA6，NF-κB and Bcl-2 in transfected cells was determined by Western blotting.RESULTS:The transfection efficiency was 57.4%.ThemRNA and protein expression of GATA6 reduced significantly after the carcinoma cell line Huh-7 being transfected by RNA interference vectorsmediated by lentivirus.The apoptotic rate of the carcinoma cellswith silent GATA6 genewas significantly increased(P＜0.05).The protein expression levels of NF-κB and Bcl-2 were also significantly decreased.CONCLUSION:Lentiviral vector-mediated RNA interference of GATA6 has an inhibitory effecton the expression of the gene itself，and promotes the apoptosis of hepatocellular carcinoma cells.Regulation of the apoptosis-related protein expression by the NF-κB signaling to influence the proliferation and apoptosis of hepatocellular carcinoma cellsmight be one of the possiblemechanisms.

［KEY WORDS］GATA6 gene;Lentivirus;RNA interference;Hepatocellular carcinoma

人类GATA结合蛋白6(GATA binding protein 6，GATA6)基因定位于18q11.1-q11.2，其编码蛋白GATA6含有2个特殊的蛋白质二级结构——锌指结构。这2个锌指结构域能结合特定的核苷酸序列(A/T)GATA(A/T)［1］。在正常的个体发育阶段，GATA6可直接与心肌组织的肌钙蛋白转录增强子结合，调节肌钙蛋白的表达;同时联系经典Wnt/β-catenin和非经典Wnt/JNK信号通路［2］，促进心肌组织成熟，在正常心血管系统和消化系统特异性分化与器官形成中发挥重要促进作用，是胚胎期发育中重要的调控基因［3］。

近年来，在胆管癌、卵巢癌等实体肿瘤中均发现GATA6的异常表达，且与肿瘤的分期和预后相关［4-5］。研究报道GATA6在结肠癌的发病及疾病进展中发挥关键作用［6］。GATA6表现出作为肿瘤治疗靶点潜在的可能性。本文旨在探讨沉默GATA6后对Huh-7细胞的抑制作用及可能的途径，为临床上治疗肝癌提供新的思路。

材料和方法

1细胞株和菌株

本实验采用人类肝细胞癌细胞株Huh-7(购自中山大学实验动物中心)，用含10%胎牛血清的DMEM培养液，在37℃、5%CO2恒温培养箱进行培养。慢病毒构建及包装中使用的肾上皮293T细胞和大肠杆菌菌株DH5α，均购自上海吉凯基因化学有限公司。293T细胞用含10%胎牛血清的DMEM培养液，在37℃、5%CO2恒温培养箱进行培养。兔抗人GATA6多克隆抗体、鼠抗人NF-κB单克隆抗体和兔抗人Bcl-2单克隆抗体均为Santa Cruz产品。

2GATA6基因RNA干扰慢病毒载体制备及感染细胞

慢病毒载体质粒PGCSIL-GFP、pHelper 1.0和pHelper 2.0均购自上海吉凯基因化学有限公司。实验分3组:(1)随机对照组(NC组);(2)空白对照组(control组);(3)实验组(shGATA6组)。构建并合成shRNA干扰片段:正义链5’-GGGAAUUCAAACCAGGAAAUU-3’，反义链3’-UUCCCUUAAGUUUGGUCCUUU-5’，把合成的引物干粉溶解于退火缓冲液中，90℃水浴15 min，然后自然冷却至室温，形成带黏性末端的双链。将shRNA和PGCSIL-GFP进行酶切连接，制备和鉴定克隆后，以Qiagen公司的质粒抽提试剂盒提取慢病毒包装系统中3种质粒DNA，用293T细胞进行病毒包装。5 d后在荧光显微镜下进行观察并拍照，确定感染效率，流式细胞术定量。

3流式细胞术分析细胞凋亡率

收集各组细胞，PBS缓冲液洗涤，胰酶消化，调整细胞密度至5×108/L，加入500μL binding buffer悬浮细胞，分别加入10μL AnnexinV-FITC和10μL PI混匀，室温避光孵育染色15 min，用FACS流式细胞仪进行双色荧光细胞流式计数，观察凋亡细胞的百分比。

4RT-PCR法检测GATA6 m RNA表达水平

转染细胞至24 h时，每组各取6孔细胞，Trizol法提取总RNA，按逆转录试剂盒说明逆转录获取cDNA，PCR仪扩增。GATA6上游引物5’-CTCAGTTCCTACGCTTCGCAT-3’，下游引物5’-GTCGAGGTCAGTGAACAGCA-3’。内参照GAPDH上游引物5’-ACCACAGTCCATGCCATCAC-3’，下游引物5’-TCCACCACCCTGTTGCTGTA-3’。反应条件:94℃5 min;40个循环，94℃45 s，57.5℃30 s，72℃10 min。PCR产物经1.5%琼脂糖凝胶电泳检测，凝胶成像。

5Western blotting检测

分别取接种在6孔板的对数生长期的慢病毒感染后的Huh-7细胞，用经过预冷的PBS缓冲液洗涤细胞2次。用滤纸吸净PBS液后，每孔加入100μL RIPA裂解液+1μL PMSF。充分裂解后，用离心机于20 000×g、4℃下离心30min，上清液即为蛋白提取液。用BCA蛋白定量试剂盒(Pierce)测定样品蛋白浓度。将样品煮沸10 min变性。蛋白上样量50 μg，以10%SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳分离蛋白，电泳转移至NC膜，置于5%脱脂奶粉(TBST配制)中室温封闭1 h。各转染组分别加入GATA6抗体(1∶100)，NF-κB抗体(1∶500)，Bcl-2(1∶500)或GAPDH抗体(1∶1 000)，4℃过夜。用TBST漂洗3次，每次10 min。加入HRP标记羊抗鼠Ⅱ抗或羊抗兔Ⅱ抗，室温下于摇床孵育2 h。再次用TBST洗膜后，ECL发光法显色，X线片曝光。

6统计学处理

用SPSS 16.0统计软件进行分析。数据用均数±标准差(mean±SD)表示，多组间比较采用单因素方差分析(ANOVA)。以P＜0.05为差异有统计学意义

结果

1肝细胞癌Huh-7细胞株中GATA6干扰慢病毒的感染效率

为了研究肝癌细胞中GATA6基因的作用，我们选用GATA6基因表达水平较高的Huh-7细胞进行GATA6基因沉默。Huh-7细胞铺6孔板，24 h后加慢病毒感染。荧光显微镜下随机选取视野，并对同一视野的细胞同时进行明视野和荧光视野的拍照，对比确定感染效率，利用流式细胞术定量检测转染效率为57.4%，见图1。

Figure 1.Huh-7 cellswere infected with the GATA6-RNAi lentivirus for 96 h(×100).图1　GATA6-RNAi慢病毒感染Huh-7细胞

2Western blotting和RT-PCR验证GATA6沉默的效率

为了了解感染了慢病毒的肝癌Huh-7细胞内源性GATA6 mRNA和蛋白表达水平的改变，我们利用RT-PCR和Western blotting法对慢病毒感染的Huh-7细胞GATA6 mRNA和蛋白表达水平进行测定。结果发现慢病毒感染Huh-7细胞后能有效降低内源性GATA6 mRNA(图2A)和蛋白(图2B)水平，差异有统计学意义(P＜0.05)。

Figure 2.RT-PCR analysis of GATA6 mRNA levels(A)and Western blotting analysis of GATA6 protein levels(B)in NC group，control group and experimental group.Mean±SD.n=3.*P＜0.05 vs NC group and control group.图2　GATA6 m RNA及蛋白在各组细胞中的表达

3慢病毒介导的GATA6沉默促进肝癌Huh-7细胞凋亡

慢病毒介导的GATA6沉默组的细胞凋亡率为(27.10±2.75)%，空白对照组和阴性对照组细胞凋亡率分别为(7.76±0.41)%和(7.70±0.45)%，实验组细胞凋亡率较空白对照组和阴性对照组明显升高(P＜0.05)，差异有统计学意义，见图3。

Figure 3.Flow cytometry of cell apoptosis in NC group，control group and experimental group.Mean±SD.n=3.*P＜0.05 vs NC group and control group.图3　流式细胞术检测各组细胞的凋亡情况

4慢病毒介导GATA6沉默可能通过NF-κB和Bcl-2途径促进Huh-7细胞凋亡

为了探讨GATA6基因抑制凋亡的分子调控机制，慢病毒感染Huh-7细胞后，我们利用Western blotting法分析Huh-7细胞GATA6以及重要凋亡相关分子NF-κB和Bcl-2蛋白表达水平，以GAPDH蛋白作内参照。结果显示，GATA6沉默后，与对照组比较，GATA6、NF-κB和Bcl-2蛋白表达量均明显降低，差异有统计学意义(P＜0.05)，见图4。

Figure 4.Western blotting analysis of NF-κB and Bcl-2 proteins in NC group，control group and experimental group.Mean±SD.n=3.*P＜0.05 vs NC group and control group.图4　各组细胞NF-κB与BCL-2蛋白的表达

讨论

NF-κB与基因启动子区的固定核苷酸序列结合而启动基因转录功能，从而调节许多重要的生理过程，包括急性期炎症免疫反应细胞的生长凋亡和肿瘤的形成。NF-κB通过上调许多抗凋亡相关蛋白，比如Bcl-2蛋白的表达而发挥抑制肿瘤细胞凋亡的作用［7］。Colo等［8］研究发现在人类慢性粒细胞白血病K562细胞中GATA6敲除能引起NF-κB表达下调从而促进凋亡的发生。

在人类大多数肿瘤细胞中，GATA6的表达增高是常见的事件。GATA6在人类胰腺上皮内瘤变组织及胰腺癌组织中高表达，进一步研究表明GATA6的拷贝数量与胰腺癌患者的预后密切相关［9］。在本研究中，我们成功构建了抑制GATA6基因的慢病毒表达载体，并包装成为病毒颗粒。再用病毒颗粒转染肝癌Huh-7细胞，证实了转染的效率，并发现Huh-7细胞中GATA6的表达下调。通过MTT实验发现肝癌细胞生长明显受到抑制，流式细胞术发现细胞凋亡比例增加。以上结果表明，下调GATA6的表达能够明显抑制细胞增殖，提高细胞凋亡。为了探讨GATA6影响细胞凋亡的机制，我们从蛋白水平分析了凋亡相关蛋白的表达情况。Western blotting结果显示NF-κB和Bcl-2蛋白水平明显下降，以上结果表明:GATA6可能通过调控NF-κB和Bcl-2蛋白来影响细胞的凋亡过程。

90%以上的胰腺癌细胞，由于Wnt信号通路激活，提高了GATA6的表达，进而加速EGFR和AKT的磷酸化，导致NF-κB的表达增加以及活性增强。持续活化的NF-κB促进细胞生长、侵袭和转移相关基因的持续表达，最终导致肿瘤的发生［10］。在部分结肠细胞中，抑癌因子microRNA-365表达受到抑制，从了促使了GATA6的激活，进一步促进了GPR49(G-protein coupled receptor 49)与NF-κB的活化，在结肠细胞的肿瘤化过程中起关键作用。GATA6作为一个促癌基因，当它的表达受到抑制时，进一步抑制NF-κB与Bcl-2的表达，导致细胞凋亡相关基因转录水平的下降，抑制了细胞的凋亡进程［4］。

在少数组织细胞中，GATA6表现为一个抑癌基因。研究表明，在人类恶性胶质瘤组织中，导致GATA6基因失效的关键突变，而正常人类脑胶质组织中未发现GATA6的突变。体外实验中，沉默胶质细胞的GATA6基因，能够增加VEGF表达，加速胶质细胞肿瘤化过程，GATA6表现出抑制肿瘤进展的作用［11］。

GATA6作为一个促癌基因，其机制被广泛讨论。GATA6特异的锌指结构能与特异的G蛋白结合，促进尿激酶型纤溶酶原激活物的活化，提高了癌细胞的侵袭和转移能力［12］。还有文献报道，下调GATA6的表达，可以提高活性氧簇的生成，进而阻滞胰腺癌细胞的增殖［13］。在本研究中，我们发现GATA6基因在肝癌Huh-7细胞中起促癌作用，抑制肝癌Huh-7细胞凋亡的作用可能是促进NF-κB与Bcl-2的表达，以上结果为肝癌基因治疗提供新的靶点。

［1］Morrisey EE，Ip HS，Lu MM，etal.GATA-6:a zinc finger transcription factor that is expressed in multiple cell lineages derived from lateral mesoderm［J］.Dev Biol，1996，177(1):309-322.

［2］Zhang Y，Goss AM，Cohen ED，et al.A Gata6-Wnt pathway required for epithelial stem cell development and airway regeneration［J］.Nat Genet，2008，40(7):862-870.

［3］Koutsourakis M，Langeveld A，Patient R，et al.The transcription factor GATA6 is essential for early extraembryonic development［J］.Development，1999，126(4):723-732.

［4］Tian F，Li D，Chen J，et al.Aberrant expression of GATA binding protein 6 correlates with poor prognosis and promotes metastasis in cholangiocarcinoma［J］.Eur J Cancer，2013，49(7):1771-1780.

［5］Cai KQ，Caslini C，Capo-chichi CD，et al.Loss of GATA4 and GATA6 Expression Specifies Ovarian Cancer Histological Subtypes and Precedes Neoplastic Transformation of Ovarian Surface Epithelia［J］.PLoSOne，2009，4(7): e6454.

［6］Tsuji S，Kawasaki Y，Furukawa S，et al.The miR-363-GATA6-Lgr5 pathway is critical for colorectal tumourigenesis［J］.Nat Commun，2014，5:3150.

［7］Sen R，Baltimore D.Inducibility ofκimmunoglobulin enhancer-binding protein NF-κB by a posttranslationalmechanism［J］.Cell，1986，47(6):921-928.

［8］Colo GP，Rosato RR，Grant S，et al.RAC3 down-regulation sensitizes human chronic myeloid leukemia cells to TRAIL-induced apoptosis［J］.FEBS Lett，2007，581 (26):5075-5081.

［9］Kwei KA，Bashyam MD，Kao J，et al.Genomic profiling identifies GATA6 as a candidate oncogene amplified in pancreatobiliary cancer［J］.PLoS Genet，2008，4(5): e1000081.

［10］Zhong Y，Wang Z，Fu B，etal.GATA6 activatesWntsignaling in pancreatic cancer by negatively regulating the Wnt antagonist Dickkopf-1［J］.PLoSOne，2011，6(7): e22129.

［11］Kamnasaran D，Qian B，Hawkins C，et al.GATA6 is an astrocytoma tumor suppressor gene identified by gene trapping ofmouse gliomamodel［J］.Proc Natl Acad Sci U S A，2007，104(19):8053-8058.

［12］BelaguliNS，Aftab M，RigiM，etal.GATA6 promotes colon cancer cell invasion by regulating urokinase plasminogen activator gene expression［J］.Neoplasia，2010，12 (11):856-864.

［13］Huang FT，Chen WB，Zhang YY，et al.MiRNA-mediated knockdown of GATA6 upregulates reactive oxygen species and inhibits SW1990 pancreatic cancer cell growth in vitro［J］.JGastroenterol Hepatol，2012，27(Suppl 5):352-353.

Effects of GATA6 silencing mediated by lentivirus on apoptosis of human liver cancer Huh-7 cells

CAIJin-lin，Aliya，HE Qiang
(Department of Hepatobiliary Surgery，The First Affiliated Hospital，Sun Yat-sen University，Guangzhou 510080，China.E-mail:lheqiang@hotmail.com)

R363

A

10.3969/j.issn.1000-4718.2015.05.030

1000-4718(2015)05-0938-05

2015-01-19［修回日期］2015-04-20

广东省教育厅自然科学研究计划项目(No.2009B030801175)

Tel:020-87755766;E-mail:lheqiang@hotmail.com