MCPH1在电离辐射诱导食管癌细胞DNA损伤通路中的作用*

吕心瑞，王保芳，王葆辉，徐晓，陈明亮△(河南大学医学院生理教研室，开封市儿童医院神经内科，河南开封475004)

·短篇论著·

MCPH1在电离辐射诱导食管癌细胞DNA损伤通路中的作用*

吕心瑞1，王保芳1，王葆辉2，徐晓1，陈明亮1△
(1河南大学医学院生理教研室，2开封市儿童医院神经内科，河南开封475004)

目的:研究MCPH1在电离辐射诱导食管癌细胞DNA损伤通路中的作用。方法:应用已构建的沉默MDC1的食管癌ECA109细胞株接受8 Gy电离辐射后1 h，检测相关因子核内斑点形成情况。构建沉默MCPH1的食管癌ECA109细胞株，检测此细胞株接受同样照射条件后相关因子核内斑点的形成情况。结果:成功构建沉默MCPH1的食管癌ECA109细胞;电离辐射使MDC1、MCPH1与γ-H2AX蛋白相互作用。沉默MDC1不影响γ-H2AX和MCPH1核内斑点的形成;沉默MCPH1使电离辐射导致的MDC1核内斑点减少，不影响γ-H2AX核内斑点的形成。结论:MCPH1在电离辐射诱导的DNA损伤通路中可能位于H2AX下游、MDC1上游，可以调控MDC1核内斑点形成。

MCPH1;电离辐射;MDC1;DNA双链损伤

［ABSTRACT］AIM:To discover the effectofMCPH1 on the DNA damage induced by ionizing radiation in esophageal cancer cells.METHODS:ECA109 cancer cells were radiated at dose of8 Gy.The nuclear foci of relevant factors were detected 1 h after irradiation in the ECA109 cells after silence of MDC1 gene.A cell linewas established thatwas stable low expression of MCPH1.The nuclear foci induced by ionizing radiation after silence of MCPH1 were determined.RESULTS:The MCPH1 gene silenced ECA109 cell line was successfully constructed.A strong relationship between MDC1，MCPH1 andγ-H2AX was observed 1 h after 8 Gy irradiation.Silence of MDC1 did not affect the nuclear foci formation of γ-H2AX and MCPH1.The nuclear fociof MDC1 but notγ-H2AX significantly reduced after silencing of MCPH1.CONCLUSION:MCPH1 is located in the downstream of H2AX and upstream formation ofMDC1，and regulates the nuclear foci formation of MDC1 during DNA damage response.

［KEY WORDS］MCPH1;Irradiation;MDC1;DNA double-strand breaks

MCPH1基因位于8号染色体短臂2区3带(8p23)上，共编码835个氨基酸，具有3个功能域。MCPH1蛋白参与细胞DNA损伤修复及染色体凝集过程，并参与细胞分裂的全过程［1］。最初是在小头畸形(microcephalia，MCPH)的病人中发现MCPH1基因变异。现在有观点认为MCPH1参与的损伤应答通路与乳腺癌的诊断、预后相关［2］。H2AX是电离辐射诱导的DNA损伤通路中的最重要和最早反应的蛋白，它的磷酸化现象——形成γ-H2AX被认为是DNA双链损伤的信号灯，并且聚集于DNA双链损伤位点，其它的调节蛋白如MDC1、53BP1接到信号后，陆续募集于相同的位置［3-5］。食管癌细胞接受电离辐射后可引起细胞内许多信号如Wnt通路下游基因的磷酸化发生改变［6］。前期的研究显示MCPH1与MDC1均参与电离辐射诱导的DNA双链损伤，电离辐射可以诱导它们核内斑点形成，并且这一现象受H2AX基因调控［7］。那么MCPH1与MDC1的关系是什么，它们之间存在相互调控关系吗?本研究主要利用小干扰RNA技术以及共聚焦显微镜方法观察两者核内斑点表达情况，检测两者之间的上下游关系。

材料和方法

1细胞株与试剂

食管癌ECA109细胞株购自上海吉凯公司;兔抗人H2AX多克隆抗体及兔抗人γ-H2AX多克隆抗体购自Bioworld;兔抗人MCPH1单克隆抗体及兔抗人MDC1单克隆抗体购自Abcam。

2方法

2.1细胞培养及细胞照射细胞贴壁生长于玻璃培养瓶，加入含1×105U/L青霉素和100 mg/L链霉素以及10%胎牛血清的RPMI-1640培养基，置于5%CO2、饱和湿度的培养箱中培养，每2～3 d传代1次。西门子直线加速器6MV-X射线照射，照射面积为20 cm×20 cm，源皮距100 cm，机架角180度，室温条件下分别照射沉默MDC1、MCPH1前后的ECA109细胞，照射剂量为8 Gy。

2.2细胞转染沉默MDC1的食管癌细胞为本实验室自行转染沉默。沉默MCPH1的病毒购自吉凯公司，用空病毒载体和沉默MCPH1的病毒载体转染ECA109细胞，用嘌呤霉素药物筛选，筛选72 h后荧光下显微镜观察转染效率，转入培养瓶中培养。

2.3用RT-PCR法检测沉默MCPH1前后ECA109细胞中MCPH1 mRNA水平采用Trizol一步法从不同实验组的ECA109细胞中提取总RNA，取等量RNA加入无核酸酶微量离心管，加入OligodT，70℃水浴孵育10 min，置于冰上5 min使RNA变性，然后分别加入10×RT反应缓冲液0.1 mol/L DTT RNA酶抑制剂及M-MLV逆转录酶，42℃孵育2 h合成cDNA，置于94℃干浴器上加热5 min终止反应。取1μL反转录产物作为反应模板，分别加入dNTP、10×PCR反应缓冲液、MCPH1或GAPDH上下游引物、Taq DNA聚合酶，加无菌水至总体积20μL，置于PCR仪上进行扩增。PCR扩增产物用1%琼脂糖凝胶电泳分离后，扫描成像。

2.4用Western blotting检测沉默MCPH1前后ECA109细胞中MCPH1的蛋白水平收集各组细胞，将细胞悬于RIPA细胞裂解液中，收集上清，用改良的Lowry法进行蛋白定量。灌制10%分离胶和5%浓缩胶。取等量蛋白样品与5×SDS上样缓冲液混合均匀，100℃水浴加热5 min使蛋白充分变性。用微量加样器将样品加入到凝胶加样孔内。电泳后，取出凝胶，进行半干转膜，然后取PVDF膜，置于含5%脱脂奶粉的封闭液中，室温封闭2 h。将封闭后的PVDF膜置入用TTBS以适当比例稀释的I抗溶液中，4℃缓慢摇动过夜。取出PVDF膜放入盛有适量TTBS平皿中，室温洗膜，然后将PVDF膜置入用TTBS 1∶20 000稀释的IRDye800CW荧光标记II抗溶液中，室温反应1 h。取出PVDF膜放入盛有适量TTBS平皿中，室温洗膜后用Odyssey发光仪检测抗体结合条带。

2.5免疫共沉淀法检测MDC1、MCPH1与γ-H2AX蛋白的表达情况分组提取蛋白后，建立250μL体系，每个体系中包括按照80μg计算的蛋白体积;3 μLγ-H2AX(MDC1、MCPH1、H2AX、IgG)兔抗体; 2.5μL PMSF，剩下的用IPH补足250μL，IgG为阴性对照用;将上述体系置于4℃摇床1 h;加protein A珠子20μL/管，摇床过夜;于4℃、12 000 r/min离心3 min，弃部分上清，加入400μL IPH，4℃摇床振荡20 min;前一过程重复4遍;于4℃、12 000 r/min离心3 min，弃尽可能多的上清，加入10～15μL 2× buffer，用手轻弹混匀，煮沸5 min;常温、12 000 r/min离心1 min;按照Western blotting的方法检测8 Gy照射后1 h时γ-H2AX、H2AX、MDC1、MCPH1及IgG的蛋白表达情况。

2.6免疫荧光检测核内斑点照射后1 h检测MDC1、MCPH1与γ-H2AX核内斑点的情况，按照免疫荧光方法，激光共聚焦显微镜显像观察。将上述细胞加3%H2O2室温孵育30 min，以消除内源性过氧化物酶的活性;多聚甲醛固定15～20 min;0.5% Triton破膜10min×2次;滴加正常山羊血清封闭液，室温60 min;滴加适当稀释的兔抗人单克隆抗体(MDC1、MCPH1和γ-H2AX均为1∶100稀释)，空白对照不加I抗，用PBS代替，室温孵育2 h;避光加入DAPI稀释(1∶2 000)的CY3标记的荧光II抗，37℃温箱、湿盒内孵育60 min，此后的所有操作步骤均为避光进行。水溶性封片剂封片(甘油∶PBS为3∶1)，激光共聚焦显微镜调至油镜下观察。

3统计学处理

结果以均数±标准差(mean±SD)表示，数据处理采用SPSS 11.7统计软件，多组均数的比较用单因素方差分析，方差分析的组间两两比较采用LSD-t检验。以P＜0.05为差异有统计学意义。

结果

1在mRNA水平检测沉默MCPH1基因的效果

在mRNA水平上沉默组与空白组比较，MCPH1的沉默效果显著(P＜0.05);空白组与空载体组无明显差异，即病毒载体对基因转录无显著影响，见图1。

Figure 1.ThemRNA expression of MCPH1 after silencing.Mean±SD.n=3.*P＜0.05 vs control.图1　m RNA水平检测MCPH1的沉默效果

2在蛋白水平检测沉默MCPH1基因的效果

在蛋白水平上沉默组与空白组相比，MCPH1的沉默效果显著(P＜0.05);而空白组与空载体组无明显差异，见图2。

3免疫共沉淀显示照射前后相关蛋白表达情况

照射前MDC1、MCPH1与γ-H2AX蛋白表达未见明显相关性，照射后1 h，MDC1、MCPH1与γ-H2AX蛋白之间发生明显的相互作用，见图3。

4应用免疫荧光法检测沉默MDC1对相关因子核内斑点的影响

电离辐射可以使γ-H2AX、MDC1和MCPH1核内斑点增加;沉默MDC1使MDC1的核内斑点减少，并不影响电离辐射导致的γ-H2AX与MCPH1核内斑点的形成，MCPH1核内斑点略有减少，差别不显著(P＞0.05)，见图4。

5沉默MCPH1对相关因子核内斑点的影响

沉默MCPH1基因不仅可使电离辐射导致的MCPH1核内斑点减少，同时可以显著减少MDC1核内斑点的形成(P＜0.05);但是沉默MCPH1基因并不影响γ-H2AX核内斑点的形成，见图5。

Figure 3.Themethod of Co-IP was used to detect the relationship between MDC1，MCPH1 andγ-H2AX 1 h after8 Gy irradiation.1～5 and 1’～5’represent the proteins of H2AX，MDC1，MCPH1，γ-H2AX and IgG before and after irradiation.图3　免疫共沉淀法显示电离辐射前后MDC1、MCPH1与γ-H2AX蛋白表达情况

Figure 4.The changes of nuclear fociof the relevant factors after silencing of MDC1.1～4 represent control group，irradiated group，silence group and silence+irradiation group，respectively.Mean±SD.n=3.*P＜0.05 vs1;△P＜0.05 vs3.图4　沉默MDC1后相关因子核内斑点的变化

Figure 5.The changes of nuclear foci of the relevant factors after silencing of MCPH1.1～4 represents control group，irradiated group，silence group and silence+irradiation group，respectirely.Mean±SD.n=3.*P＜0.05 vs1;△P＜0.05 vs3.图5　沉默MCPH1后相关因子核内斑点的变化

讨论

研究显示电离辐射诱导的细胞损伤中最重要的就是DNA双链损伤，而H2AX磷酸化对DNA损伤后的MCPH1斑点形成起着举足轻重的作用，我们在前期的研究中证实，H2AX磷酸化是DNA双链损伤的标志，H2AX磷酸化形成γ-H2AX，一些调节器如MDC1、53BP1聚集到DNA损伤位点，与γ-H2AX相互作用，形成核内斑点，通过ATM通路调节下游的CHK2等因子。而近些年来发现的MCPH1也位于H2AX下游，电离辐射导致的MCPH1核内斑点形成依赖H2AX磷酸化即γ-H2AX［7-8］。那么MCPH1与MDC1是什么关系?它们之间是否存在相互调控关系至今仍不清楚。一些实验已经检测了应用siRNA技术敲低MCPH1后DNA损伤的情况［9-12］，包括从细胞周期检测缺陷到斑点形成消失，主要是由于DNA损伤应答中一些重要的调节器和效应器蛋白之间不能相互作用，从而导致细胞周期中正常的G2/M期无法顺利转换。

我们的实验结果显示电离辐射导致了γ-H2AX与MCPH1及MDC1非常明显的相互作用，这种相互作用在未照射时是不存在的。为了解MCPH1在DNA损伤通路中的具体位置及调控因素，我们照射沉默MDC1的食管癌细胞，结果显示MCPH1斑点形成并不依赖MDC1，这一结果与Jamie等［13］的报道相似，他认为MCPH1在电离辐射后形成的斑点并不依赖一些调节器蛋白，如MDC1、53BP1和BRCA1。而照射沉默MCPH1基因的食管癌细胞可以减少MDC1斑点的形成，这就说明MCPH1在DNA损伤诱导通路中扮演了一个在初期就起作用的角色，它只受H2AX磷酸化过程调控。MDC1已被证实在DNA损伤检测通路中是一个调节器，负责包括NBS1、53BP1、BRCA1在内的许多监测点蛋白的募集反应［14-16］，并促进更多H2AX于DNA损伤位点磷酸化，来扩大DNA损伤信号级联反应［17］。那么MCPH1位于MDC1的上游，它直接影响了MDC1核内斑点的形成，沉默MCPH1后一方面减弱MCPH1在DNA损伤通路中的作用，并且必然使其下游的MDC1作用削弱，从而影响DNA损伤传导通路的完整。能否通过影响这一通路调节食管癌细胞放射敏感性是我们下一研究的重点。

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Effect of MCPH1 on irradiation induced DNA damage in esophageal cancer cells

LÜXin-rui1，WANG Bao-fang1，WANG Bao-hui2，XU Xiao1，CHEN Ming-liang1
(1Department of Physiology，Medical College of Henan University，2Department of Neurology，Kaifeng Children Hospital，Kaifeng 475004，China.E-mail:chml163@163.com)

R363.1+21

A

10.3969/j.issn.1000-4718.2015.05.027

1000-4718(2015)05-0924-05

2014-11-17［修回日期］2015-03-04

国家自然科学基金资助项目(No.U1404310);河南大学博士启动基金(No.B2013043)

Tel:0371-23885855;E-mail:chml163@163.com