STAT1对人非小细胞肺癌H1299细胞增殖及IFN-β敏感性的影响*

赵嘉璐，孙筱茹，季东翔，陈俊杰，王梦怡，蒋磊，李玉苹，陈成水△(温州医科大学附属第一医院呼吸与危重症医学科，浙江温州5000;宁波市第二医院重症医学科，浙江宁波5000;温州医科大学附属第一医院内科实验室，浙江温州5000)

STAT1对人非小细胞肺癌H1299细胞增殖及IFN-β敏感性的影响*

赵嘉璐1，孙筱茹1，季东翔1，陈俊杰1，王梦怡2，蒋磊3，李玉苹1，陈成水1△
(1温州医科大学附属第一医院呼吸与危重症医学科，浙江温州325000;2宁波市第二医院重症医学科，浙江宁波315000;3温州医科大学附属第一医院内科实验室，浙江温州325000)

目的:探讨信号转导及转录激活因子1(signal transducer and activator of transcription 1，STAT1)对人非小细胞肺癌H1299细胞增殖及人重组干扰素β(interferon-β，IFN-β)敏感性的影响。方法:构建STAT1基因慢病毒过表达载体Lenti-STAT1，转染H1299细胞，建立稳定表达STAT1的细胞株，EGFP转染组作为对照，观察各组细胞生长情况。用不同浓度的IFN-β处理各组细胞，观察对细胞的生长抑制作用。Western blot法检测各组细胞内p-STAT1、ICAM-1和PCNA的蛋白水平。结果:成功构建稳定过表达STAT1及对照EGFP的H1299细胞株。过表达STAT1的H1299细胞的增殖活性明显低于EGFP对照组(P＜0.05)，其对IFN-β的敏感性显著高于EGFP对照组(P＜0.05)。过表达STAT1上调活化的STAT1磷酸化水平，下调ICAM-1表达。并且，STAT1增强IFN-β诱导的STAT1磷酸化水平，下调PCNA表达。结论:过表达STAT1可抑制H1299细胞增殖，增强细胞对IFN-β的敏感性，为STAT1基因联合IFN-β治疗非小细胞肺癌提供了实验基础。

信号转导及转录激活因子1;H1299细胞;干扰素β;肺癌

［ABSTRACT］AIM:To investigate the effect of signal transducer and activator of transcription 1(STAT 1)on proliferation and interferon-β(IFN-β)sensitivity of human non-small-cell lung cancer H1299 cells.METHODS:STAT1 or EGFP gene was transfected into H1299 cells by the lentiviral vectors system.The cell number was counted under amicroscope and cell proliferation was tested by MTT assay.In addition，the cells transfected with STAT1 and EGFP were treated with IFN-βand cell viability wasmeasured by MTT assay.The protein levels of p-STAT1，ICAM-1 and PCNA were detected by Western blot.RESULTS:Over-expression of STAT1 inhibited H1299 cell proliferation(P＜0.05).H1299 cells transfected with STAT1 gene had a higher sensitivity to IFN-βthan the control cells transfected with EGFP(P＜0.05).Overexpression of STAT1 increased the protein levelof p-STAT1，and reduced IACM-1 expression in H1299 cells.Moreover，STAT1 enhanced STAT1 phosphorylation and downregulated the expression of PCNA in H1299 cells treated with IFN-β.CONCLUSION:STAT1 inhibits the proliferation and enhances the IFN-βsensitivity of non-small-cell lung cancer H1299 cells.

［KEY WORDS］Signal transducer and activator of transcription 1;H1299 cells;Interferon-β;Lung neoplasms

肺癌是常见的恶性肿瘤，严重危害人类健康，我国肺癌的发病率和死亡率逐年上升，已经成为第一位的癌症死因［1］。目前虽然化学药物、外科手术及放射治疗方法有了很大的改进，但患者5年的生存率仍然低于15%［2］，所以寻找治疗肺癌的新方法有着重要意义。

信号转导及转录激活因子(signal transducer and activator of transcription，STAT)最重要的功能是参与机体免疫应答和调控细胞增殖与转化［3-4］。STAT1是STAT家族中第一个被发现的成员，Ⅰ型干扰素(IFN-α/β)和Ⅱ型干扰素(IFN-γ)可通过JAK-STAT通路激活STAT1参与细胞生长调节、抗病毒和免疫防御［5-6］。Meraz等［7］和Durbin等［8］发现STAT1基因剔除的小鼠对任何一种干扰素(interferon，IFN)刺激均无反应，说明STAT1参与了IFN诱导的信号转导过程。目前，STAT1在肺癌中的作用及机制尚不清楚。本研究中，我们将STAT1基因转染人非小细胞肺癌H1299细胞观察其对细胞增殖的影响，及其是否增强IFN-β抗肿瘤作用，并探讨可能的机制，为肺癌的治疗提供实验依据。

材料和方法

1细胞培养

人胚肾239T细胞和非小细胞肺癌H1299细胞购买于上海中科院细胞库。293T细胞用含10%胎牛血清和1%双抗的高糖DMEM培养基，H1299细胞用含10%胎牛血清、1%双抗的RPMI-1640培养基，置于37℃、5%CO2培养箱中培养。

2材料

慢病毒载体Lenti-STAT1和Lenti-EGFP已于前期构建［9］。人重组IFN-β(R＆D);BCA蛋白浓度测定试剂盒、预染蛋白质Marker、膜封闭液和ECL发光液(Thermo);鼠抗人ICAM-1单抗和鼠抗人STAT1单抗(BD);兔抗人p-STAT1单抗(CST);鼠抗人PCNA单抗(Abcam);MTT、鼠抗人β-actin单抗、HRP标记的山羊抗鼠II抗和山羊抗兔II抗(联科生物公司)。

3方法

3.1慢病毒载体包装和转染细胞将携带STAT1基因的慢病毒载体Lenti-STAT1或携带EGFP基因的对照载体Lenti-EGFP与包装质粒PMK-VSVG、PMDL-G/P-RRE、PRSV-REV用CaCl2转染法共转染293T细胞。第2天更换细胞培养基。继续培养48 h后，收集293T细胞上清液，超速离心，弃上清，用TBS液重悬病毒沉淀。常规培养的H1299细胞接种于24孔板中，慢病毒感染细胞，同时加入聚凝胺以增加感染效率，48 h后显微镜观察绿色荧光强度。

3.2细胞计数检测细胞增殖能力使用24孔平底的细胞培养板，各孔接种细胞1.5×104个。分别在1 d、2 d和3 d经胰酶消化后置于显微镜下计数。

3.3MTT法检测细胞增殖活性使用96孔平底的细胞培养板，各孔接种细胞3 000个。分别在1 d、2 d和3 d时加20μLMTT溶液，4 h后终止培养，弃上清，每孔加150μL DMSO，振荡10 min，使结晶物充分溶解。酶联免疫检测仪下选择波长450 nm测定各孔吸光度。根据各组细胞的吸光度值绘制出细胞生长曲线。将各组细胞以每孔1 000个接种于96孔细胞培养板，无血清培养液饥饿培养24 h后行药物干预。用不同浓度的IFN-β(浓度分为1×104、1× 105和1×106U/L)处理各组细胞，72 h后处理组和未处理组分别采用MTT法检测各组的吸光度值，计算各组细胞的生长抑制率。

3.4Western blot实验收集各组细胞，提取蛋白，用BCA法测定蛋白浓度。每组取40μg蛋白样品经12%聚丙烯酰胺凝胶电泳分离后转移至PVDF膜，用含5%脱脂奶粉的TBST缓冲液室温封闭2 h后，I抗4℃孵育过夜，TBST缓冲液洗膜3次，加II抗室温孵育2 h，再用TBST缓冲液洗膜3次，ECL化学发光显色，X光显影。

4统计学处理

采用SPSS 17.0统计软件进行分析，数据以均值±标准差(mean±SD)表示。多组间均数的比较均采用单因素方差分析，以P＜0.05为差异有统计学意义。

结果

1细胞绿色荧光蛋白和STAT1蛋白的检测

慢病毒转染H1299细胞48 h后，荧光显微镜可观察到绿色荧光蛋白表达，Western blot实验结果显示转染STAT1组H1299细胞STAT1蛋白过表达，见图1。

2STAT1过表达对人非小细胞肺癌H1299细胞增殖及IFN-β敏感性的影响

稳定转染后的H1299细胞经显微镜下计数后结果显示，Lenti-STAT1组细胞的数量明显低于Lenti-EGFP对照组(P＜0.05)。经MTT法检测绘制生长曲线显示，Lenti-STAT1组细胞的增殖活性明显低于lenti-EGFP对照组(P＜0.05)。各组H1299细胞用不同浓度的IFN-β处理72h，MTT法检测计算细胞生长抑制率。Lenti-STAT1组细胞在各浓度IFN-β处理后，其细胞的生长抑制率显著高于Lenti-EGFP对照组(P＜0.05)，见图2。

3STAT1过表达对H1299细胞p-STAT1、ICAM-1和PCNA蛋白表达的影响

Western blot实验结果发现，同EGFP组细胞相比，lenti-STAT1组细胞的p-STAT1(Tyr701)蛋白水平明显升高，而ICAM-1蛋白水平明显低于对照组。在1×106U/L IFN-β干预72 h后，与EGFP组细胞相比，Lenti-STAT1组细胞的p-STAT1蛋白水平明显升高，PCNA的蛋白量明显低于对照组，见图3。

Figure 1.The expression of green fluorescent protein in H1299 cells transfected with Lenti-STAT1 by immunofluorescence(A，×100)and the protein expression of STAT1 in H1299 cells transfected with Lenti-STAT1 determined by Western blot(B).Mean±SD.n=3.*P＜0.05 vs Lenti-EGFP.图1　慢病毒Lenti-STAT1转染效果及转染后STAT1蛋白的表达情况

Figure 2.Effects of STAT1 overexpression on the proliferation and IFN-βsensitivity of H1299 cells.A:overexpression of STAT1 inhibited H1299 cell growth;B:overexpression of STAT1 inhibited the proliferation of H1299 cells detected by MTT assay; C:effect of STAT1 overexpression on the sensitivity of H1299 cells to IFN-βfor 72 h.Mean±SD.n=4.*P＜0.05 vs Lenti-EGFP.图2　STAT1过表达对H1299细胞增殖及IFN-β敏感性的影响

讨论

JAK-STAT信号转导途径是细胞因子信号转导中最常见、最直接的途径，参与细胞的增殖、分化、凋亡以及免疫调节等重要的生物学过程［3］。STAT1是STAT家族第一个发现的成员，通常被认为是一种肿瘤抑制蛋白［10］，研究结果显示STAT1在乳腺癌、黑素瘤中及白血病扮演抑癌基因的角色［11-13］。STAT1的抑癌作用主要是通过上调caspases 2，3和7［14］、细胞周期蛋白依赖性激酶抑制剂1A［15］和IRF1/p53通路的表达［16］。虽然STAT1作为抑癌基因被逐渐认识，但其在肺癌中的作用尚不明确。

我们课题组前期通过Western blot检测了40例肺癌组织及邻近肺正常组织中STAT1蛋白的表达，结果显示晚期肺癌组织STAT1表达显著低于早期肺癌组织［17］，提示STAT1可能在肺癌发生、发展中扮演重要角色。本研究中，我们利用慢病毒表达载体携带STAT1基因［9］转染非小细胞肺癌H1299细胞，观察STAT1对H1299细胞增殖的影响。结果发现，STAT1过表达组的细胞增殖活性明显低于对照细胞，STAT1在肺癌中可能作为抑癌基因抑制肺癌细胞的生长。

Figure 3.Effects of STAT1 overexpression on the protein levels of p-STAT1，ICAM-1 and PCNA in H1299 cells.A:overexpression of STAT1 increased the protein level of p-STAT1，reduced the expression of IACM-1;B，C:STAT1 enhanced STAT1 phosphorylation and downregulated the expression of PCNA in H1299 cells treated with IFN-βfor 72 h.Mean±SD.n=3.*P＜0.05 vs Lenti-EGFP.图3　STAT1过表达对H1299细胞p-STAT1、ICAM-1和PCNA蛋白表达的影响

同时，我们发现STAT1可以增强IFN-β对肺癌细胞生长的抑制作用。IFN/STAT1信号转导通路是介导宿主微环境成分和肿瘤细胞之间的代表性通路，调节肿瘤细胞的生长［18-19］，而IFN诱导的信号转导和肿瘤免疫监视则需要STAT1的参与［20］。IFN-β用于血液系统恶性肿瘤等多种肿瘤的治疗并取得了一定的成功［21］，但IFN-β半衰期短，需要提高用药剂量才会对肿瘤产生毒性作用［22］。而一些肿瘤患者对干扰素治疗缺乏反应或者耐药，可能与肿瘤细胞STAT1缺失相关。我们的研究结果也提示过表达STAT1能增加肿瘤细胞对干扰素的敏感性，为干扰素联合STAT1基因治疗肺癌提供了实验依据。

ICAM-1与肿瘤的复发、转移密切相关。ICAM-1的表达随着肿瘤恶性程度的增高而增强，与肿瘤的分级及预后有关，可作为判定肿瘤侵袭的指标之一［23］。课题组前期研究显示STAT1在肺癌早期中的表达明显高于晚期［17］，而ICAM-1则恰恰相反，这提示我们肺癌组织中STAT1和ICAM-1的表达可能存在负相关。进一步研究发现，STAT1可通过活化STAT1的磷酸化，下调ICAM-1的表达进而抑制肺癌细胞的生长。PCNA即增殖细胞核抗原，参与细胞周期的调节，是反映细胞增殖活性的标志物，与肿瘤细胞的侵袭、转移及预后相关［24］。范贤明等［25］用免疫组化方法检测发现非小细胞肺癌组织中的STAT1与PCNA呈明显负相关。在本研究中，我们用IFN-β干预细胞，发现STAT1能增强IFN-β诱导的STAT1磷酸化水平，下调PCNA的表达，提高了IFN-β对肺癌细胞的生长抑制作用。

基因治疗是疾病治疗的有效途径，而慢病毒载体的研究已成为基因治疗的研究热点，本实验通过慢病毒表达载体在人非小细胞肺癌H1299细胞中过表达STAT1基因，发现STAT1通过促进STAT1磷酸化水平，抑制ICAM-1表达，抑制肿瘤细胞增殖。同时过表达STAT1增加细胞对IFN-β的敏感性，其分子机制可能主要通过增强IFN-β诱导的STAT1磷酸化水平。综上所述，我们的研究为STAT1基因联合IFN-β治疗肺癌提供了实验依据，并可能为未来肺癌的治疗提供新的思路。

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Influence of STAT1 on proliferation and IFN-βsensitivity of human nonsmall-cell lung cancer H1299 cells

ZHAO Jia-lu1，SUN Xiao-ru1，JIDong-xiang1，CHEN Jun-jie1，WANG Meng-yi2，JIANG Lei3，LIYu-ping1，CHEN cheng-shui1
(1Department of Respiratory and Critical Care Medicine，The First Affiliated Hospital of Wenzhou Medical University，Wenzhou 325000，China;2Department of Intensive Care Unit，Ningbo No.2 Hospital，Ningbo 315000，China;3Laboratory of Internal Medicine，The First Affiliated Hospital of Wenzhou Medical University，Wenzhou，325000，China.E-mail: chenchengshui@126.com)

R734.2;R730.23

A

10.3969/j.issn.1000-4718.2015.05.015

1000-4718(2015)05-0852-05

2015-01-05［修回日期］2015-02-12

国家自然科学基金资助项目(No.81400035);温州市科技计划项目(No.20140052)

Tel:0577-55578186;E-mail:chenchengshui@126.com