巴氏杆菌诊断技术研究进展

许泽芳+谢永兴+郭树源+赵翠+常维山

摘要： 本文主要对巴氏杆菌当前比较流行的诊断技术进行了汇总，并且引用了当前国内外的一些研究成果并进行了分析。对该菌的分子生物学诊断技术的灵敏度和特异性进行了介绍，对此病原菌的实验室研究提供了多种方法，最后展望了其分子生物学方法应用于实践的前景和存在的问题，为进一步开展基础研究提供了思路。

关键词：巴氏杆菌;诊断技术;应用

中图分类号：S854.4      文献标识码：A      文章编号：1673-1085（2015）03-0038-04

巴氏杆菌病（Pastenrellosis）是由巴氏杆菌属细菌引起畜禽共患的一种急性传染病，主要是由多杀性巴氏杆菌引起，发生于各种家畜、家禽、野生动物和人类的一种传染病的总称。本病为世界性分布，近年来，由于饲养环境恶劣、药物的滥用、继发感染或动物机体自身的抵抗力低下等原因，巴氏杆菌的感染病例数量及感染物种不断扩大，关于野生动物的病例报道也很多[1]。患病动物急性病例往往以败血症和炎性出血过程为主要特征，慢性经过时则表现为皮下组织、关节、各脏器的局灶性化脓性炎症。在兽医临床上，以由多杀性巴氏杆菌感染引起的禽霍乱、猪肺疫、牛出血性败血症以及由溶血性巴氏杆菌某些亚型引起的羊的溶血性巴氏杆菌败血症等最为多见。

根据Bengey's 细菌学鉴定手册，引起巴氏杆菌病的病原主要有 4种，即多杀性巴氏杆菌（P.multocida）、溶血性巴氏杆菌（P.heamolytica）、嗜肺巴氏杆菌（P.pneumotropica）和脲巴氏杆菌（P.ureae）等[2，3]。本属细菌除致病作用和血清型不同外，其形态和培养特性几乎完全一致。

应用常规的诊断方法诊断巴氏杆菌虽然具有许多优点， 但由于多杀性巴氏杆菌抵抗力不强，在直射阳光、干燥、无菌蒸馏水和生理盐水中迅速死亡，且诊断时存在费时、费力、敏感性低、漏诊、误诊的缺点，应该寻找新的诊断技术，利用现代科学技术为养殖户挽回损失。随着分子生物技术的不断应用和发展，现代分子生物学技术如核酸杂交技术、聚合酶链式反应（PCR） 技术、限制性片段长度多态性分析（RFLP）、核苷酸序列分析和基因芯片等， 将在疾病的准确、快速诊断中扮演重要角色。

1  病原学诊断

巴氏杆菌正常存在于多种健康动物的口腔和咽部黏膜，当动物处于应激状态，机体抵抗力低下时，细菌容易侵入体内，大量繁殖并致病，发生内源性传染。因此掌握一些基本的诊断技术是相当关键的，特别是依靠一些普通的实验微生物诊断技术尤为关键。

1.1  巴氏杆菌的分离培养  分离培养可用患病动物的组织、肝脏等新鲜病料，接种于鲜血琼脂平板、马丁氏血清琼脂平板、麦康凯琼脂平板和血清肉汤培养基等营养物质高的培养基上，马丁氏血清琼脂平板上菌落微隆起、呈圆形、灰白色露滴状，中等大小。在血琼脂平板上长成水滴样小菌落，溶血性巴氏杆菌出现溶血，但多次传代后溶血性也会消失，多杀性巴氏杆菌则无溶血环。在血清肉汤中培养，开始轻度浑浊，4～6h 后液体变清亮，管底部出现粘稠沉淀，震摇后不分散，表面形成菌环。巴氏杆菌在麦康凯琼脂上生长缓慢甚至不生长，菌落为红色。在本属中，多杀性巴氏杆菌是危害畜、禽最为严重的一种，从患病的动物体液或组织中分离培养得到的菌落基本上分为两种：一种为通过45°折光，在低倍显微镜下呈现鲜明的蓝绿色而带金光，边缘有狭窄的红黄色带的Fg菌落型，相当于血清型乙型。对小白鼠、家兔和猪毒力强大，每只注射活菌10～200个即可致死，而对家禽每只必须注射10个以上才可致死;另一种为在45°折光下，菌落呈现橘红色，边缘稍带狭窄的黄绿光的FO菌落型，相当于血清型甲型。对鸡、鸽毒力强大，对猪的毒力较次，家兔对两型的致死量无甚差异。在中国，牛、猪、驴和马的多杀性巴氏杆菌病绝大多数为Fg型菌所致，家禽流行性巴氏杆菌病都是FO型菌所致。慢性病例中偶尔发现菌落较小、折光下呈现淡蓝色的菌落。自病兔分离的菌落也都是FO型。

1.2  巴氏杆菌的染色与镜检  将患病动物的组织渗出液、肝、脾、淋巴结、骨髓等新鲜组织涂片或制作成触片，用瑞氏染色液或碱性美兰液染色，五分钟后放在油镜下镜检，能够发现典型的两极浓染的短杆菌，即菌体两端染色深，中间浅，无鞭毛，不形成芽孢，用印度墨汁等染料染色，可见清晰的荚膜，就可以初步诊断为巴氏杆菌感染。纯培养物进行革兰氏染色、镜检，可见紫红色且两端钝圆的革兰氏阴性球杆状或短杆状菌。

1.3  巴氏杆菌的生化试验鉴定  多杀性巴氏杆菌在48h内可分解葡萄糖、果糖、单奶糖、蔗糖和甘露糖，产酸不产气。一般不发酵乳糖、鼠李糖、菊糖、水杨苷和肌醇，可产生硫化氢，能形成靛基质，M.R.和V-P试验均为阴性。接触酶和氧化酶试验均为阳性。溶血性巴氏杆菌不产生靛基质，能发酵乳糖产酸，能发酵葡萄糖、糖元、肌醇、麦芽糖、淀粉;不发酵侧金盏花醇、菊糖和赤藓醇。

1.4  动物实验  可用病畜的病料乳剂制成1：10悬液，或用已制成的分离培养菌，皮下注射小鼠、家兔或鸽，动物多在24～48h内死亡。由于健康动物呼吸道内常可带菌，所以应参照病畜的生前临床症状和剖检变化、分离培养、生化特性作出最后诊断。

2  血清学诊断技术

若要鉴定荚膜抗原和菌体抗原型，则要用抗血清或单克隆抗体进行血清学实验。检测动物血清中的抗体，可用试管凝集、间接凝集、琼脂扩散实验或 ELISA 等方法。

2.1  乳胶凝集试验  在制好的巴氏杆菌乳胶液中滴加稀释的免疫血清0.2～0.7ml，边加边摇，当出现肉眼可见的颗粒后，仍继续加血清，直至颗粒消失，成为均匀的乳胶悬液为止。镜下检查应无自凝。使用时，应与一定稀释度的相应抗原出现阳性反应，与生理盐水出现阴性反应为合格。同时以正常血清代替免疫血清进行乳胶致敏，以作对照。endprint

取洁净玻璃板一块，用玻璃铅笔划成小格，滴加待检样品0.1ml，再滴加高免血清致敏乳胶0.01ml，以牙签或火柴杆混匀，在3min内判定结果。根据乳胶凝集的情况来判定。

2.2  酶联免疫吸附法（ELISA）  ELISA分为间接ELISA（i-ELISA）和竞争ELISA（C-ELISA），可用于血清及乳汁样本中巴氏杆菌的检测，该法在国内外均有商品化检测试剂盒，国内也有类似研究。

国外已报道用多杀性巴氏杆菌毒素（PMT）作为包被抗原建立检测PMT抗体的ELISA方法，但PMT纯化步骤复杂，其中的一些杂蛋白很难除尽，给推广应用带来不便。卢顺[4]等利用多杀性巴氏杆菌毒素基因的原核表达产物免疫小鼠制备单抗并利用酶标单抗建立了单抗竞争ELISA法用于检测PMT抗体。李兴玉等[5]通过提取猪巴氏杆菌菌株的荚膜和外膜蛋白抗原，首次建立了检测猪巴氏杆菌病血清抗体的Dot-PPA-ELISA方法，确定了抗原的最佳包被浓度为7.76ul，酶标SPA的最佳稀释倍数为1：10。钱建飞等[6]应用抗鸡IgM单克隆抗体建立了检测鸡抗多杀性巴氏杆菌血清中特异性IgM抗体的抗体捕获ELISA（Mac-ELISA），本法具有很高的特异性和良好的重复性。

3  DNA指纹技术

目前已有不少利用DNA指纹对多杀性巴氏杆菌分离株进行分类的研究报导[7]。有人曾利用随机引物PCR （AP-PCR）鉴别了猪呼吸道多杀性巴氏杆菌分离株和免疫火鸡多杀性巴氏杆菌分离株。该技术是建立于RFLP基础上的，具有高度的特异性和稳定的遗传性等优点。然而这种方法需采用放射标记来提高其检测的灵感度，因此限制了该技术的应用。该技术可用同位素标记或者荧光素标记方法从而使菌体基因组中富含某种核苷酸，大大提高了对扩增片段检测的灵敏度。国内有人用随机扩增多态性DNA-PCR方法检测实验小鼠的嗜肺性巴氏杆菌，结果表明，该法简便、快捷，具有事先不需要知道被检菌的基因序列、对试验条件要求不严格等优点。此外，基因组重复序列PCR （REP-PCR）指纹在鉴别鸟源和猪源多杀性巴氏杆菌分离株时具有比较高的鉴别能力。

4  基因芯片技术在巴氏杆菌诊断中的应用

基因芯片技术能在单一检测中从种、亚种、型和亚型水平上同时鉴定多种病原，为多病原联合检测和病原分型提供了一项新技术。基因芯片技术具有敏感性高、特异性强、高通量和平行性的优点。它可将待鉴定病原的多个特征性基因片段固定于玻片等载体上制成检测或鉴定芯片，不仅可利用PCR的敏感性和简便性，还能在一次试验中同时分析目标微生物的多个基因，从而克服因PCR高敏感而引起的非特异性[8]。肖国生[9]等利用七个从胸膜肺炎放线杆菌、猪肺炎支原体和多杀性巴氏杆菌3种病菌基因组中扩增出的不同特异性靶DNA制作成基因芯片，用来诊断三种细菌的感染。程亚楼[10]通过选择16-23S rDNA 间区序列为靶序列，设计了6种特异性探针实现对多杀性巴氏杆菌、猪大肠杆菌、胸膜肺炎放线杆菌、副猪嗜血杆菌、金黄色葡萄球菌和猪链球菌的鉴定。

5  其它PCR 技术在巴氏杆菌诊断中的应用

聚合酶链反应（PCR）技术因具有简便、快速、敏感性高和特异性强的优点， 现已广泛应用于微生物检测、遗传病诊断等诸多领域。当前PCR技术仍然是检测巴氏杆菌的主要方法。而PCR检测扩增用引物大多根据Pm的16SrRNA和KMT基因设计[11，12]，经Pm 16SrRNA和plpE基因的序列分析得知，Pm 16SrRNA与APP、HPS 16SrRNA序列相似性均达93%以上，所以根据Pm 16SrRNA建立的PCR存在不足之处。APP、HPS不含有plpE基因且不同血清型Pm plpE基因序列相似性在92%以上。黄海燕[13]等根据plpE基因是多杀性巴氏杆菌的特异保守基因这一特性，从而建立了以plpE基因为基础的多杀性巴氏杆菌特异性PCR方法，并用该方法对来自四川的6个规模化养猪场的64份疑似多杀性巴氏杆菌感染的样品进行初步检测，64份疑似样品中的36份诊断为多杀性巴氏杆菌阳性，检测结果与经传统细菌分离鉴定的结果基本一致，进一步说明以多杀性巴氏杆菌的plpE基因建立的PCR方法的可靠性和实用性。

2001年，Townsend等利用基因消减的方法对多杀性巴氏杆菌进行研究，发现了多杀性巴氏杆菌基因组上1个特有区域，针对该多杀性巴氏杆菌特异性DNA序列设计引物，所有的多杀性巴氏杆菌都可以扩 增 出1个460bp的 片 段，即Pm-PCR[14]。Hricinova等建立了Pm、HPS和APP的多重PCR，检测结果与细菌分离鉴定结果相符合[15]。2004年，Kamp等经GenBank在线序列比对发现多杀性巴氏杆菌的翻译调节基因（Pm0762-Pm1231）不存在于其它任何细菌，由此建立的多杀性巴氏杆菌PCR检测方法具有种属特异性。Kamp等根据T+PM的毒素基因建立检测T+PM的PCR，并证明其与ELISA结果相同[16]。

PCR技术以其特异性、敏感性、快速、简便和对标本的纯度要求低的优点， 现已广泛应用于微生物检测， 不需要分离病毒或细菌及培养细胞，DNA 粗制品及RNA均可作为扩增模板，可直接用临床标本如血液、体腔液、洗嗽液、毛发、细胞、活组织等DNA扩增检测，尤其对培养困难的细菌检测和抗原结构复杂的细菌鉴定，具有常规方法无法比拟的优越性。

6  展望

巴氏杆菌的分子生物学诊断方法具有诊断确实、灵敏度高、特异性强和诊断迅速等一系列优点，因此在日常生产实践中具有广阔的应用前景。目前巴氏杆菌的分子生物学方法在科研工作中已经得到一定的应用。随着人们对巴氏杆菌认识的不断深入，为预防和治疗此病提供了一定的实验依据。但是分子生物学方法对于确诊也存在一定的误差率，单独使用一种方法的诊断效率往往不高，目前对于巴氏杆菌的实验室诊断和研究多是几种实验方法联合起来应用，而不是单用其中的一种方法，例如常规方法与PCR 法连用、常规法与克隆表达的连用、ELISA- PCR法、PCR- DNA探针法等，这些方法的联合使用使准确率得到提高。但是分子生物学方法的应用具有价格昂贵的缺点，在实际诊断中仍以眼观和剖检为主，误差率较大。应大力研究分子生物学方法，降低生产成本，使其在不久的将来成为一种成熟的诊断技术。endprint

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